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heute: Ein Gen ist ein DNA-Abschnitt, der für eine RNA codiert! 2 Der Aufbau von DNA und RNA DNA (Desoxyribonucleinsäure) Doppelstrang Verwunden in Form der Doppelhelix Proteine wie Histone wickeln die DNA um sich auf und machen sie Kompakt Langlebig Aufbau der Nukleotide Basen Basenpaare - Adenin Tymin Cytosin Guanin DNA-Rückrad Phosphatgruppe Zucker in Form von Desoxyribose Adenin komplementär zu Tymin Cytosin komplementär zu Guanin Basenpaare sind mittels Wasserstoffbrücke verbunden RNA (Ribonukleinsäure) Einzelstrang Statt der Base Tymin ist Uracil anzutreffen Also: Adenin ist komplementär zu Uracil Zucker ist in Form von Ribose Kurzlebig Kann sich auch zu einer komplexen dreidimensionalen Struktur falten, so wie z. B. die r-RNA also die Ribosomale RNA aus welcher die Ribosomen bestehen 3 Die Funktion der verschiedenen RNA-Typen Messenger-RNA (m-RNA) Geht aus der Transkription hervor, wird von RNA-Polymerase synthetisiert. Stellt den Boten der genetischen Information dar, indem sie diese von der DNA zu den Ribosomen bringt. Ribosomale-RNA (r-RNA) Bildet die Grundstruktur der Ribosomen, also der Ober- und Untereinheit. Transfer-RNA (t-RNA) Aminosäuren befinden sich an ihr und sie bringt diese zu den Ribosomen. Beladung passiert mittels hochspezifischer Enzyme, die Aminoacyl-t-RNA- Synthetasen Diese binden zunächst die passende Aminosäure Anschließend kann die zugehörige t-RNA mit dem passenden Anticodon an das Enzym binden Beide werden verknüpft und danach wieder freigesetzt Sie besitzt das Anticodon in Form eines Basentripletts, welches für die Translation wichtig ist. Sie stellt also ein Adapter zwischen m-RNA und Aminosäure dar. Sieht aus wie ein T, da die Basen der RNA so sind, dass sie teilweise komplementär zueinander sind und dadurch die T-Struktur entsteht 4 Die Transkription - Initiation: Die RNA-Polymerase erkennt eine spezifische Basensequenz eines Gens, den Promotor. Die RNA-Polymerase bindet an dem Promotor, er reguliert die Transkription (Transkriptionsfaktoren) Promotor bestimmt auch, wo die Transkription beginnt und welcher DNA-Strang von der RNA-Polymerase abgelesen wird Elongation: Die DNA wird von der RNA-Polymerase ab einer bestimmten Basensequenz (dem Startsignal) blasenartig geöffnet, die Wasserstoffbrücken werden getrennt und die Doppelhelix wird entwunden. Die Größe dieser Öffnung beträgt nur einige Nukleotide, danach schließt sich die DNA wieder und windet sich wieder zur Doppelhelix. Die RNA-Polymerase liest den codogenen Strang in 3¹ -> 5¹ Richtung ab. Die RNA-Polymerase synthetisiert komplementär zum codogenen Strang die mRNA, also in 5' -> 3' Richtung. Dabei fügt sie den komplementären Nukleotiden immer am 3¹ Ende der mRNA an. Besonderheit: Auf der mRNA wird statt Tymin Uracil angefügt! Termination: Ein Stoppsignal auch Stoppsequenz oder Terminator auf der DNA beendet schließlich den Transkriptionsprozess, der DNA-Abschnitt schließt sich wieder und der mRNA-Strang löst sich. Infos: Auch die t-RNA und rRNA (RNA der Ribosomen) entsteht durch die Transkription. Begriffe Codogener Strang: Die Information eines Gens ist lediglich in einem der beiden Doppelstränge erhalten, diesen nennt man codogener Strang oder Matrizenstrang 5 Die Translation Initiation: Ein mit einer Aminosäure geladenes t-RNA Stück bindet mit seinem Anticodon an den Startcodon der m-RNA, dies startet die Translation. Die Ribosomen Untereinheit bindet an die m-RNA und lagert sich an der Stelle des Startcodons ab. Die Ribosomen Obereinheit setzt sich auf die Untereinheit und beiden umschließen die m-RNA. Die Ribosomen stellen eine A-, P- und E-Stelle bereit. Auf der P-Stelle liegt das erste t-RNA Stück, welches an dem Startcodon der m-RNA gebunden ist. Elongation: 1. Ein beladenes t-RNA Stück aus dem Cytoplasma bindet mit seinem Anticodon an dem Codon der m-RNA auf der A-Stelle des Ribosoms. 2. Die gebundenen Aminosäuren der beiden t-RNA Stücke der A- und P-Stelle werden mithilfe eines Enzymes zu einer Peptidkette verbunden. 3. Die Peptidkette befindet sich nun an den t-RNA Stück der A-Stelle, das t-RNA Stück der P-Stelle hat keine gebundene Aminosäure mehr, ist nicht beladen. 4. Das Ribosom bewegt sich ein Basentriplett auf der m-RNA weiter in 5¹ -> 3¹ Richtung, sodass das t-RNA Stück der P-Stelle auf die E-Stelle rutscht und das t-RNA Stück der A-Stelle auf die P-Stelle. (Letzteres hat die Peptidkette) 5. Das unbeladene t-RNA Stück auf der E-Stelle löst sich von der m-RNA und verlässt das Ribosom. Dieser Prozess wiederholt sich immer wieder bis zur Termination, die Peptidkette wird jeden Durchgang um eine Aminosäure erweitert und wird zur Polypeptidkette (Siehe 2.) Termination: Tritt ein, wenn Codon der m-RNA keiner zu übersetzender Aminosäure entspricht, also keine t-RNA mit komplementärem Anticodon existiert (Ist also ein Stopp-Codon) An dem Codon der m-RNA der A-Stelle bindet stattdessen ein Release-Faktor, dieser stoppt die Translation Verbleibendes t-RNA Stück auf der P-Stelle und Release-Faktor auf der A-Stelle löst sich von der m-RNA Polypeptidkette löst sich von t-RNA Stück und nimmt Raumstruktur ein Ribosomen Ober- und Untereinheit lösen sich von der m-RNA Fertiges Protein entsteht aus der Polypeptidkette 6 Entschlüsselung und Eigenschaften des genetischen Codes Entschlüsselung des genetischen Codes Gereinigte Ribosomen, Gemisch mit allen 20 Aminosäuren und ein mRNA Basentriplett mit bekannter Basensequenz wird im Reagenzglas gemischt Eine der Aminosäuren, von Versuch zu Versuch wechselnd, wurde radioaktiv markiert Gemisch wird gefiltert Filter hat Porengröße, sodass Ribosomen hängen bleiben, kleinere Teilchen jedoch durch den Filter durch gehen Ist das Radioaktive Signal noch im Filter auffindbar? Falls ja: Die hinzugefügte mRNA Sequenz codiert die markierte Aminosäure Warum? Da die radioaktiv markierte Aminosäure an der t-RNA im - Ribosom gebunden ist und das Ribosom nicht durch Filter passt Fall nein: Die hinzugefügte mRNA Sequenz codiert nicht die markierte Aminosäure, da die markierte Aminosäure durch den Filter passt Später war es möglich ganze bekannte regelmäßige mRNA-Sequenzen zu synthetisieren und anschließend die Aminosäuren des entstandenen Polypeptids zu bestimmen, um nach und nach die gesamte Code-Sonne bestimmen zu können Eigenschaften des genetischen Codes 1. Es ist ein Triplett-Code, also sind 3 Basen ein Codon und diese codieren immer jeweils eine Aminosäure Warum genau ein Basentriplett? Weil es pro Base 4 verschiedene Zustände gibt und es deshalb nötig ist, mindestens 3 codierende Basen zu haben um alle 20 verschiedene Aminosäuren zu codieren. (4² = 16 also nicht genug | 4³ 64 also genug) = 2. Er ist universell, alle Lebewesen benutzen dieselbe Sprache, der Code codiert unabhängig vom Lebewesen dieselbe Aminosäure (Bis auf wenige Ausnahmen) 3. Er ist eindeutig, jedes Codon codiert nur eine Aminosäure 4. Er ist redundant, es gibt mehrere mögliche Tripletts für eine Aminosäure 5. Er ist kommafrei, es gibt keine Lücke zwischen den einzelnen Codons der mRNA 6. Er ist nicht überlappend, eine Base ist immer nur Bestandteil eines Codons 7 Genmutation Typen und Konsequenzen Stumme Mutation Hat keine Auswirkung auf das exprimierte Polypeptid Eine Punktmutation im Intron ist immer stumm Eine Punktmutation im Exon kann auch stumm sein Es verändert sich hier zwar das DNA-Triplett und dementsprechend auch das Codon auf der m-RNA Allerdings wird es aufgrund der Redundanz des genetischen Codes trotzdem dieselbe Aminosäure translatiert Missense-Mutation - Punktmutation liegt im Exon vor Redundanz hilft hier allerdings nicht, das veränderte DNA-Triplett und dementsprechend auch das veränderte Codon auf der m-RNA translatiert eine andere Aminosäure. Phänotypische Auswirkungen unklar Kann Enzymaktivität verringern, falls betroffene Aminosäure sehr wichtig ist Keine großen Folgen für Merkmal, falls betroffene Aminosäure ähnlich der originalen ist oder an einer nicht ganz so relevanten Stelle ist Nonsence-Mutation Ein Triplett, welches eigentlich für eine Aminosäure codiert wird durch Punktmutation zum Stopp-Codon. Deshalb endet die Translation verfrüht Gebildetes Polypeptid ist in den meisten Fällen funktionslos Merkmal ist defekt Genmutation durch Insertion oder Deletion Basenpaare sind eingefügt oder entfernt Leseraster ist verschoben: Rastermutation Alle nachfolgenden Basentripletts sind deshalb anders, sie codieren völlig andere Aminosäuren Protein ist völlig verändert 8 Proteinbiosynthese bei Pro- und Eukaryoten im Vergleich Transkriptionseinheit Genaufbau Räumliche Organisation Zeitliche Organisation Reifung der mRNA DNA-Aufbau Ribosomenaufbau Posttranslationale Modifikation Prokaryoten (Bakterienzellen) mRNA beinhaltet oft mehrere Gene, es werden mehrere Proteine codiert. Diese dienen oft für denselben Stoffwechselvorgang Nur Exons, also alle Sequenzen sind codierend DNA ist Ringförmig, Keine Histone 70S-Ribosomen Eukaryoten (Tier- und Pflanzenzellen) Exons und Introns, nicht alle Sequenzen sind codierend (Mosaikgen) Transkription und Translation Transkription im Zellkern, im Cytoplasma Transkription und Translation finden parallel gleichzeitig hintereinander statt Translation im Cytoplasma Transkription muss erst beendet sein, dann Translation Nein keine Prozession, Transkription und dann direkt Translation, da nur Exons vorhanden sind Zwischen Transkription und Translation wird die prä- mRNA durch Spleißen, Capping und Anheften des Poly-A-Schwanzes prozessiert DNA ist fadenförmig, wird um Histone gewickelt 80S-Ribosomen Keine Modifikation der Polypeptide mRNA beinhaltet nur ein Gen und codiert also nur die Synthese eines einzelnen Proteins Polypeptide werden nach Translation noch häufig modifiziert 9 mRNA-Prozessierung (Spleißen, alternatives Spleißen, posttranslationale Modifikation) Exons: Codierende Sequenzen auf der DNA, wichtig für Polypeptidkette Introns: nicht codierende Sequenzen auf der DNA, keine Informationen für die Polypeptidkette Spleißen: Sowohl die Exons und Introns werden von der RNA-Polymerase in eine Vorstufe der mRNA transkribiert, der prä-mRNA Die Introns werden von den Spleißosomen aus der prä-mRNA herausgeschnitten, die an den Seiten benachbarten Exons werden zu einer zusammenhängenden mRNA verknüpft Am 5¹ Ende der mRNA wird eine cap-Struktur angehängt. Sie besteht aus einem methylierten Guanin Am 3¹ Ende der mRNA wird ein Poly-A-Schwanz angehängt Cap-Struktur und Poly-A-Schwanz schützen vor Abbau der mRNA durch Enzyme und erleichtern den Transport aus dem Zellkern. Also längere Lebensdauer der mRNA. Auch ermöglicht sie die korrekte Anlagerung der Ribosomen. Posttranslationale Modifikation: Nach der Translation werden Polypeptide häufig noch verändert Ein bestimmter Aminosäurenabschnitt im Mittelteil macht es zum Beispiel möglich, dass das Polypeptid im Golgi-Apparat modifiziert wird. Manche sind erst aktiv nach anhängen von Seitengruppen Signalpepide sorgen dafür, dass das Protein an den Bestimmungsort gelangt Der Mittelteil wird dort durch Enzyme entfernt und das fertige Protein besteht aus zwei Polypeptidketten die zusammengehalten werden Alternatives Spleißen: Von Proteinen wird anhand von bestimmten Sequenzen an den beiden Enden der Introns erkannt, wo die Grenzen zwischen Exon und Intron liegen. (Splice site) Erst während des Spleißens wird bestimmt, was rausgeschnitten wird, Introns werden aber immer rausgeschnitten. Dadurch können auch einige Exons zusätzlich rausgeschnitten werden, was in Folge das codierte Protein verändert Welche der Exons auch rausgeschnitten werden variiert zwischen verschiedenen Zelltypen. Die Reinfolge der Exons kann auch verändert werden, was ebenfalls das codierte Protein verändert, Dadurch sind die verschiedenen Zelltypen erst so verschieden 10 Genregulation Prokaryoten - Substratinduktion Begriffe: - Strukturgen: Gen, welches Proteine mit enzymatischer Funktion codiert Promotor: Bindungsstelle der RNA-Polymerase Operator: Steuert, ob Strukturgene abgelesen werden oder nicht Operon: Einheit auf der DNA mit Strukturgenen, Promotor und Operator Repressor: Bindet an Operator und verhindert da die Transkription Substrat: Bindet an Repressor und aktiviert oder inaktiviert ihn dadurch Regulatorgen: Codiert für Repressor, befindet außerhalb des Operons exprimieren: Gene aktivieren, um Enzyme für eine bestimmte Aufgabe zu synthetisieren Substratinduktion (Am Beispiel des lac-Operon) Kontrolliert die Gene zum Abbau eines bestimmten Stoffes (Lactose) Die regulierten Gene codieren für Enzyme des Lactoseabbaus Gene werden exprimiert um Lactose abzubauen und damit zu verwerten Die Lactose startet also selber den Prozess der Enzymherstellung. Sie führt ihren eigenen Abbau herbei Das Eingangsprodukt steuert hier also! Ablauf: 1. Regulatorgen wird außerhalb des Operons transkribiert und translatiert, ein aktives Repressorprotein ist das Produkt 2. Das aktive Repressorprotein bindet an den Operator 3. Dadurch kann die RNA-Polymerase nicht an den Promotor binden und somit die Strukturgene nicht transkribieren 4. Wenn Lactose in der Zelle ist bindet sie an den Repressor 5. Dadurch verändert dieser seine Struktur und er wird inaktiv, er kann nicht mehr an den Operator binden 6. Die RNA-Polymerase kann nun die Strukturgene transkribieren 7. Die entstehenden Enzyme können nun die Lactose abbauen 8. Wenn die Konzentration an Lactose wieder gering ist, löst sich das Substrat Lactose von dem Repressor 9. Der Repressor kann wieder an den Operator binden und die Transkription wird wieder blockiert 10. So wird gesteuert, dass nur Enzyme produziert werden, wenn sie für den Abbau benötigt werden Wichtig: Das Substrat (Lactose) verändert den Zustand des Repressors von aktiv zu inaktiv! 11 Genregulation Prokaryoten - Endproduktrepression Endproduktrepression (Am Beispiel des Tryptophan Operon) Kontrolliert die Gene zum Aufbau eines bestimmten Stoffes (Tryptophan) Die regulierten Gene codieren für Enzyme, die Tryptophan herstellen Gene werden exprimiert, um genug Tryptophan in der Zelle zu haben Die Enzyme für die Herstellung von Tryptophan werden standardmäßig immer hergestellt, außer wenn genug Tryptophan vorhanden ist. Das Endprodukt steuert hier also! Ablauf: Regulatorgen wird außerhalb des Operons transkribiert und translatiert, ein inaktives Repressorprotein ist das Produkt. Das inaktive Repressorprotein kann NICHT an den Operator binden Die RNA-Polymerase kann deshalb an den Promotor binden und transkribiert die Strukturgene Die Strukturgene werden translatiert und das Produkt sind Enzyme, welche Tryptophan synthetisieren, Tryptophan wird hergestellt Ist genug Tryptophan in der Zelle bindet es an den Repressor, dieser ändert seine Raumstruktur und wird nun aktiv Der aktive Repressor bindet an den Operator Die RNA-Polymerase kann dadurch nicht mehr an den Promotor binden Die Strukturgene werden nicht mehr transkribiert und die Enzyme für die Tryptophan Synthese werden nicht mehr hergestellt So wird gesteuert, dass nur Tryptophan hergestellt wird, wenn nicht genug in der Zelle vorhanden ist Wichtig: Das Substrat (Tryptophan) verändert den Zustand des Repressors von inaktiv zu aktiv! 12 Genregulation Prokaryoten - Positive Genregulation Positive Genregulation (Am Beispiel des lac-Operon) ACHTUNG KOMPLIZIERT! Transkriptionsrate wird neben der Aufhebung der negativen Genregulation (Siehe Substratinduktion) durch der positiven Genregulation gesteigert Zuerst wird die Glucose verbraucht, danach kommen erst die Enzyme des Lactoseabbaus Glucose reguliert zusätzlich das lac-Operon Wenn Glucose da ist = Weniger Enzyme des Lactoseabbaus Ablauf: ATP - - ATP Das Enzym Adenylatcyclase (aktiv) und das CAP (inaktiv) wird außerhalb des lac-Operons transkribiert und translatiert Aktive Adenylatcyclase wandelt ATP (Adenosintriphosphat) in cAMP um CAMP bindet an das CAP, wodurch CAP seine Raumstruktur ändert und aktiv wird Aktiviertes CAP bindet am Promotor des lac-Operons Dadurch wird die Affinität der RNA-Polymerase am Promotor deutlich erhöht Wichtig: Das Substrat Glucose verändert den Zustand des Enzyms Adenylatcyclase von aktiv zu inaktiv! Wichtig: Das Substrat cAMP verändert den Zustand des CAP von inaktiv zu aktiv! Die Strukturgene des lac-Operons werden viel häufiger exprimiert Also gibt es mehr Enzyme für den Lactoseabbau Wenn Glucose an Adenylatcyclase bindet ist das Enzym ist nun inaktiv ATP wird nicht mehr in cAMP umgewandelt Es bindet nichts mehr am CAP, es ist nun inaktiv und löst sich vom Promotor Die Affinität der RNA-Polymerase ist wieder normal, die Strukturgene werden nicht mehr so häufig exprimiert und es gibt weniger Enzyme für den Lactoseabbau Keine Glucose vorhanden: Adenylatcyclase (aktiv) Glucose vorhanden: Adenylatcyclase (inaktiv) -> CAMP CAMP Also: CAMP bindet an CAP, CAP wird aktiv CAP bindet an Promotor, erhöhte Affinität Also cAMP bindet NICHT an CAP, CAP bleibt inaktiv und bindet nicht an Promotor Keine erhöhte Affinität 13 Genregulation Eukaryoten Die Genregulation bei Eukaryoten findet auf verschiedenen Ebenen statt: Chromatinumstrukturierung Das Chromatin wird gelockert damit Gene für Transkription erreichbar sind Durch Anheften von Acetylgruppen Durch Abspalten von Methylgruppen Transkription Transkriptionsfaktoren binden am Promotor neben RNA-Polymerase Häufige Bindungsstelle ist die TATA-Box Es sind zusätzliche Proteine als Transkriptionsfaktoren erforderlich Sie binden an regulatorische DNA-Abschnitte Diese Abschnitte sind allerdings weit vom regulierten Gen entfernt Deshalb bildet die DNA Schleifen, damit die dort gebundenen Proteine mit dem Promotor und den hier gebundenen Proteinen in Kontakt kommt Enhancer erhöhen die Transkriptionsrate Silencer verringern die Transkriptionsrate RNA-Prozessierung Beim alternativen RNA-Spleißen können auch einige codierende Exons herausgeschnitten werden (Siehe alternatives RNA-Spleißen) Dadurch können die Proteine so verändert werden, dass sie keine Funktion mehr haben und so reguliert werden RNA-Interferenz Mi-RNA Stücke werden von der DNA codiert, werden also transkribiert Sind Einzelsträngig, falten sich aber zu einem Doppelstrang Enzyme befördern sie in das Cytoplasma RISC-Proteinkomplexe binden an die miRNA Zerlegen sie zu Einzelsträngen Lagern sie an ihrer Oberfläche an Die Sequenz einer der beiden Stränge ist komplementär zu einer Teilsequenz der zu regulierenden mRNA Deshalb bindet der Komplex an dieser mRNA - Dadurch wird die Translation in den Ribosomen gestört und bricht ab Der gesamte Komplex wird abgebaut, es ist kein Protein entstanden Translation der mRNA am Ribosom Mehrere Ribosomen translatieren dieselbe mRNA Abbau der Proteine Translationsrate steigt, da viele Proteine aus einer mRNA entstehen Posttranslatische Modifikation An Polypeptidkette wird nach der Translation angehangen Phosphatgruppen oder Zuckerketten Dadurch werden diese entweder aktiv oder inaktiv Ist reversibel, kann also Rückgängig gemacht werden Proteasome können Polypeptidketten abbauen und damit die Proteine regulieren 14 Epigenetische Regulation. Epigenetik bedeutet veränderte Genfunktion, welche nicht mit Veränderung der DNA- Sequenz in Verbindung stehen. Sie werden häufig durch Umwelteinflüsse bestimmt Unterschiede werden mit steigendem Alter bei eineiigen Zwillingen immer stärker, da andere Umwelteinflüsse Ist reversibel, passt sich den Umwelteinflüssen stetig an Wenn Keimzellen von der Veränderung betroffen sind können diese vererbt werden Die epigenetischen Eigenschaften (z.B.: Methylierungsmuster) werden bei der Zellteilung weitergegeben Dafür sorgt die Erhaltungsmethylase Bei Krebs sind oft durch die epigenetische Regulation wichtige Gene mit Schutzmechanismen oder Reperaturmechanismen inaktiv Sie heißen Tumorsupressorgene Wichtige Gene für die Zellteilung können auch fälschlicherweise methyliert und damit ausgeschalten sein Es gibt verschiedene Ebenen wo epigenetische Einflüsse stattfinden Methylierung der DNA - DNA-Methyltransferasen setzen Methylgruppen an die Base Cytosin - Demethylase kann Methylgruppen wieder entfernen RNA-Polymerase kann das Gen nicht mehr ablesen Auf den Histonen (Chromatinstruktur) Bestimmen wie stark die DNA verpackt ist Zu stark verpackt (Heterochromatin) kann nicht von der RNA- Polymerase abgelesen werden Lockere Form (Eurochromatin) kann abgelesen werden Histonenschwanz dient zur Bindung chemischer Gruppen Dadurch wird Struktur des Chromatins verändert (Verpackungsgrad der DNA) Mögliche Bindungen: Methylgruppen (Methylierung) DNA wird komprimiert Gene können schlechter oder nicht mehr abgelesen werden Acetylgruppen (Acetylierung) DNA wird gelockert Gene werden häufiger abgelesen 15