Genetik

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weil die Atome zu einem seckseckigen Molekül angeordnet sind Adenin und Thymin verbinden sich über zwei Wasser- stoffbrücken, Guanin und Cytosin verbinden sich über drei Wasserstoffbrücken Funktion -geschlechtliche und ungeschlechtliche Weitergabe der Erb- information (Vererbung) Informationsspeicher für Proteine, die Zellbestandteile Cytokinese - Teilung des Cytoplasma kontraktiler Ring verengt Mutter- zelle, dadurch entstehen zwei Tochterzellen Ergebnis: Gleichmäßige Verteilung der Erbsubstanz auf die Tochter- zellen Anaphase ·() Nukleinsäure 5' D/Z Р D/Z D/Z Р 3' Metaphase Adenin ITA Thymin D/Z C Chromatid LTDLA x Guanin 1 D/Z C'G 3' Cytosin D/Z. -Desoxyribose Phosphat- gruppe DIZ -Nukleotid D/Z 5' Nukleinsäure RNA Ribonukleinsäure Speicherung von genetischen Informationen und arbeiten enzymatisch. m-RNA (messenger) = codieren Proteine t-RNA (transfer) = Adapter zwischen m-RNA und Aminosäuren bei der Proteinbiosynthese r-RNA (ribosomal) = bilden die Grundstruktur der Ribosomen und katalysieren die Protein- biosynthese DNA - RNA Folgestrang Polymerase 5' Xuww 3' Ligase 5 Leitstrang HOCH ₂ O OH 3' H OH OH H Primase Ribose Polymerase HC || HC Uracil NH HOCH ₂ O OH Phosphorsäurerest Phosphorsäurerest Ribose (Pentose) Desoxyribose (Pentose) Adenin, Thymin, Guanin, Cytosin - Adenin, Uracil, Guanin, Cytosin Doppelsträngig Einzelsträngig DNA Replikation Entspiralisierung des DNA-Doppelstrangs durch die Topoimerase und Spaltung der Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den Basen durch die Helicase Einzelstrangbindende Proteine ve indern eine Wiederverbindung Primase stellt RNA-Primer her und befestigt sie am Folgestrang DNA-Polymerase knüpft an den Strängen komplementäre Nukleotide an (kommen vom Cytoplasma) Leitstrang: DNA-Polymerase arbeitet in 5' - 3' Richtung Folgestrang: Primer werden immer wieder angelagert, damit sie als Startpunkt für die Synthese in 3' - 5' Richtung dienen -> der neu synthetisierte Strang besteht aus Okazaki-Fragmente Polymerase verknüpft DNA-Nukleotide stückweise H H3C Desoxyribose OH HK H Thymin H ssb-Proteine - NH 5 Phosphatgruppe Adenin Helikase RIZ R/Z P R/Z 3' 5' 71 R/Z Primer werden entfernt, Lücken werden mit DNA aufgefüllt Ligase verbindet alle DNA-Stücke und Okazaki-Fragmente = zu jedem der beiden Einzelstränge wurde der komplementäre Tochterstrang synthetisiert Guanin G' Topoisomerase 3' u Uracil Identische Verdopplung der DNA | C einzelsträngig mRNA, +RNA, rRNA Base Uracil, statt Thymin Ribose statt Desoxyribose Cytosin Zwei Einzelstränge Leit- und Folgestrang (Mutterstrang) Leitstrang (5' 3'), Folge- strang (3' - 5') Ableserichtung: 3' - 5' DNA-Polymerase: 5' - 3' Leitstrang- kontinuierlich Folgestrang - diskontinuierlich Ribose PCR Ablauf - die PCR findet in den folgenden 3 Phasen statt die verschiedenen Phasen werden im Thermocycler durch die Regulierung der Temperatur ein- geleitet Denaturierung erhitzen auf 94 - 96°C (20-30 sek.) - die Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den komplemen- tären Basen werden gebrochen Doppelstrang wird in seine beiden Einzelstränge getrennt Elongation Verlängerung erhitzen auf ca. 72°C = PCR Primerhybridisierung = Anheftung schnelles Abkühlen auf 50-65°C (20-40 sek.) gezielten Vervielfältigung von DNA- Abschnitten in sehr kurzer Zeit -> die genaue Temperatur hängt von der Primerlänge ab Anlagerung der Primer an die Einzelstränge die hitzestabile Verknüfung auf beiden Strängen (3' nach 5' aus Sicht des Mutterstrangs) die Dauer dieser Phase hängt von der DNA-Länge ab (30sek. Pro 500 Basenpaare) Anfang 1. Zyklus 2. Zyklus PCR und DNA-Replikation im Vergleich - 3. Zyklus Ergebnis Die Vervielfältigung der DNA-Stränge läuft exponentiell ab, weil letztlich aus jedem Strang ein Neuer entsteht. Doppelstrang der DNA wird durch Temperatur getrennt (94-96°C) - künstliche DNA-Primer gesetzt (längere Primer) verläuft an beiden Einzelsträngen kontinuier- lich (verläuft immer von 3' zu 5') - Verwendung der hitzestabilen Taq-Polymerase DODI DOO DNA-Repilkation DOD →DODI DOO DOD DIDIA DOO DOO DOO DOO DOO DOO DOO DNA Doppelstrang wird durch das Enzym Heli- case aufgetrennt - RNA-Primer durch Primase gesetzt (kürzere Primer) verläuft am Leitstrang kontinuierlich und am Folgestrang diskontinuierlich Verwendung von DNA-Polymerase Die Code-Sonne Mit der Gensonne kann man den genetischen Code in die entsprechenden Aminosäuren setzen. Folgende Regeln gelten: lesen von 5' nach 3' (von Innen nach außen) Triplett-Code (3 basen codieren für eine Amino- säure kommafrei (ohne Pausenzeichen) und keine Überlap- pung zwischen den Tripletts Degeneration: jedes Triplett codiert für eine Ami- nosäure, aber eine Aminosäure kann durch mehrere Tripletts codiert sein Universell: gilt für alle Lebewesen AUG Startcodon (Met- Methionin UAA, UAG, UGA = Stopcodon Ala-Alanin Arg Arginin Asn-Asparagin Asp Asparaginsäure Cys - Cystein Gln-Glutamin Glu-Glutaminsäure Gly - Glycin His Histidin lle - Isoleucin Beispiele DNA A AD MRNA AMO AAG GOM MAA Met Lys Gly Stop 3 Val Arg Ser Ala Lys Asp 101 Asn Glu G Thr Tau 10204 A A ACAGUC C Gly Leu - Leucin Lys Lysin Met Methionin Phe - Phenylalanin Pro Prolin 3' Phe Leu GU lle U G 3' Arg - C - - Ser ope Tyr A Gin A А G ACUGHS His Ser Serin Threonin Thr Trp Tryptophan Tyr - Tyrosin Val - Valin Pro DNA ANA WAO MRNA MM MAM OM AAM વિષય નિતિન Val Tyr Ala Asn Stop Stop Cys Trp Leu Die Erbinformation der DNA wird mRNA umgeschrieben, dazu muss die DNA den Zellkern nicht verlassen (Informationsübertragung). Stop Proteinbiosynthese Die Proteinbiosynthese ist die Herstellung von Proteine über die Transkription und die Translation aus den Erbinformationen der DNA. Prokaryoten und Eukaryoten Die DNA befindet sich bei den Eukaryoten im Zellkern. Die DNA bei den Prokaryoten befindet sich im Cytoplasma, da sie keinen Zellkern haben. Bei den Eukaryoten muss die Kopie der DNA ins Cytoplasma gebracht werden, dafür gibt es die RNA-Prozessierung. Dies findet zwischen der Transkription und der Translation statt. Transkription 3' Ablauf - RNA-Polymerase lagert sich an die Promoter-Region des transkribierenden DNA Gens an Thymin -> Adenin Guanin Die RNA Polymerase trennt die Wasserstoffbrücken zwischen den Basen Adenin -> Uracil und öffnet den Doppelstrang, dadurch entsteht der Codogene Strang (3' - 5'). Am 3' beginnt die Transkription und am 5' endet sie. die RNA Polymerase liest Nukleotide ab und die Nukleotide mit den komplementären Basen werden herangeführt und zur mRNA verbunden Am Sense Strang (mRNA) (5'-3') ist bei 5' ist der Promoter, bei 3' der Terminator, dadurch weiß die RNA-Polymerase, wo Cytosin Guanin -> Cytosin sie anfangen und aufhören soll DNA-Nicht- matrizenstrang die RNA und die RNA-Polymerase lösen sich von der DNA -> DNA wickelt sich wieder zusammen Ergebnis: Ein mRNA-Einzel- strang; bei Eukaryoten die prä-mRNA 5 3' 5₁ www.g mRNA UMANO Ableserichtung RNA-Polymerase Capping Modifiziertes Guanin-Nukleotid an 5'-Ende Erkennungszeichen für das Ribosom und Schutz vor chemischen Zersetzungsprozessen auf dem Transportweg Polyadenylierung 5' 5'-Cap Anhängen des Poly-A-Schwanz (Adenin-Nukleotide) ans 3' -Ende - Schutz vor chemischen Zersetzungsprozessen auf dem Trans- portweg Editing Austausch einiger Nukleotide Die Änderung der Nukleotidsequenz erhöht die Proteinvielfalt Spleißen Merke: Eukaryotische Gene sind Mosaikgene und bestehen aus Introns und Exons. комм Entfernen der Introns (nicht-codierend - keine Übersetzung bei der Transkription) Zusammenfügen der Exons (codierend) RNA-Prozessierung Die prä-mRNA wird bei Eukaryoten, bevor sie als reife mRNA den Zellkern verlässt, dem Prozess des Spleißens unterzogen -> RNA 1 RNA-Nukleotide MANY 5' DNA-Matrizenstrang, codogener Strang (enthält das Gen) 3' Poly-A-Schwanz Prä-mRNA Exon Intron Exon Intron Exon 2 3 1 2 mRNA Exon Exon Exon Protein Ergebnis Aus der unreifen prä-mRNA entsteht nach der Prozessierung die reife mRNA. Die mRNA wird in ein Protein übersetzt Proteine sind lange Ketten von Arminosäuren, die Erbinformationen (Reihenfolge...) findet man in der DNA -> Information wurden auf mRNA kopiert mRNA besteht aus vielen Nucleotiden, 3 Basen werden in eine Aminosäure übersetzt Translation Ribosom es hat drei Stellen - Aminoacyl-Stelle (Eingang), Polypeptid-Stelle, Exit-Stelle (Ausgang) -> ein Codon (drei basen) kann sich an einer Stelle befinden wandert die mRNA entlang bis zu einem Start Codon Ablauf mRNA bindet sich an das Ribosom Das Ribosom erkennt ein Startcodon und führt die pas- sende tRNA an die A-Stelle an 1. das Innere des Zellkerns 2. Zellmembran 3. Cytoplasma 4. DNA-Doppelhelix 5. mRNA 6. Ribosom 7. freie tRNA 8. Aminosäure 9. beladene tRNA 10. Peptidkette (Aminosäurenkette) II. Transkription 12. Zellkernpore 13. freie Nucleotide 14. Codon der mRNA 15. RNA Polymerase 16. Translation DX 9 14 AUG Die tRNA geht weiter an die P-Stelle, da eine weitere tRNA mit komplementären Anticodon sich an die A-Stelle anlagert (wandert in 3' -Richtung) -> Das Ribosom wandert immer ein Triplett weiter - an der P-Stelle löst sich die Aminosäure von der tRNA und die tRNA wandert zur E-Stelle und löst sich von der mRNA - die tRNA von der A-Stelle wandert dann eine Stelle weiter und eine neue tRNA mit Aminosäure bindet sich an das Ribosom (A-Stelle) -> dadurch entsteht eine Polypeptidkette Der Vorgang wiederholt sich so lange bis ein Stopcodon abgelesen wird -> das Ribosom zerfällt und gibt das Polypeptid frei 5' ooo AVE Met Pro Tyr 5 tRNA 10 Asp CUA UGCCG UGCC GUACGAUCCGUACGA Joypo ooo E PA XXXX Met نے UAC AUG (3 Pro GG C 16 3' Genregulation Prokaryoten Genregulation bezeichnet die Steuerung der Aktivität von Genen. Sie bestimmt, ob das von dem Gen codierte Protein in der Zelle gebildet wird, zu welcher Zeit & Menge. Denn viele Enzyme, Hormone werden in Zellen ständig benötigt (= konstitutive Gene), andere sind nur unter bestim- mten Bedingungen erforderlich und müssen nach Bedarf an, abgeschaltet werden (= regulierte Gene). Die Proteinbiosynthese kostet viel Energie und die Genregulation spart diese Energie. Das Operon-Modell / Jacob-Monod-Modell Ein prokaryotisches Gen besteht aus folgenden Einheiten: Strukturgene: enthalten die genetische Information zur Bildung der Enzyme Regulatorgen: enthält die Information zur Bildung eines Repressorproteins Repressor: Protein, das die Enzymsynthese unterbinden kann Operator: DNA-Abschnitt, an den das Repressor-Protein reversibel bindet Promoter: DNA-Abschnitt, an den die RNA-Polymerase bindet XXXXXX Regulatorgen Promotor Lactose XXXXXX Operon Operator inaktiver Repressor Lac-Operon ohne Lactose Regulatorgen Substratinduktion am Beispiel Lactose Bei der Substratinduktion wird die Polymerase zu Beginn durch einen aktiven Repressor blockiert und die Gene werden nicht abgelesen. Dieser Repressor wurde zuvor durch das Regulatorgen ge- bildet. Wenn ein Substrat in die Umgebung gelangt: Das Substrat bindet an den aktiven Repressor Die Stelle an die die Lactose bindet ist das allosterische Zentrum Der Repressor löst sich und verändert seine Form, er wird deaktiviert Die Polymerase kann dann die Gene ablesen und die Proteine bilden Lac-Operon mit Lactose Regulatorgen Promotor Operator Gen 1 Proteinbio- RNA- synthese Polymerase Gen 2 Promotor Operator Gen 3 Strukturgene Transkription Lacz RNA- Polymerase Lacz aktiver Repressor DDDDDY Endproduktrepression am Beispiel Tryptophan Bei der Endproduktrepression blockiert das Endprodukt die weitere Bildung der Proteine. Das passiert ab einer bestimmten Konzentration, also, wenn genug davon gebildet wurde. Es passiert genau das Gegenteil als bei der Substratinduktion: Das Regulatorgen produziert einen inaktiven Repressor Die Polymerase kann die Strukturegene also in Ruhe ablesen Die Konzentration des Proteins steigt die Aminosäure Tryptophan bindet an den inaktiven Repressor und aktiviert ihn Der Repressor verändert seine Form und bindet an den Promotor und blockiert ihn Die Stukturgene können nicht mehr abgelesen werden, stop der Transkription Trp-Operon mit Tryptophan trp-Gene Regulatorgen Trp-Operon ohne Tryptophan Regulatorgen Promotor Operator Proteinbio- synthese Stop der Transkription inaktiver Repressor Eukaryoten mRNA Transkription aktiver Repressor trp-Gene Translation RNA- Polymerase Tryptophan (Trp) Die Genregualtion dient bei Eukaryoten dazu, die Entwicklung von Zellen zu steuern. Die Gene bestimmen, welche Funktion die Zelle ausübt und welche Form sie hat (Differenzierung der Zellen). Es kostet eine Menge Energie zu jeder Zeit alle Gene umzusetzen. Manchmal brauchen die Zellen nicht alle Genprodukte auf einmal. Durch die Genregulation wird nur das gebildet, was auch gebraucht wird. Sie hilft beim Energie sparen. Man unterscheidet bei Eukaryoten zwischen eine Genregulation vor und nach der Transkription. Prä-transkriptionale Regulation (vor der Transkription) - DNA ist um Histone gewickelt -> Histone sind einfache Proteine Sind diese eng miteinander verpackt, kann die DNA nicht abgelesen werden Sind diese locker miteinander verpackt, kann die DNA abgelesen werden Methylierung Methylierung schaltet Gene ab - Methylgruppe wird an die DNA gehangen - Verstärkung der Anziehungskräfte zwischen Histonen und der DNA die Histone rücken dadurch nah zusammen es gibt keinen Platz zum Ablesen der DNA Acetylierung & Phosphorylierung - die Acetylierung und die Phosphorylierung schalten Gene an Acteyl- o. Phosphatgruppe wird an die DNA ge- hängt Bewirkt Abschwächung der Anziehungskräfte zwischen Histonen und DNA die Histone rücken auseinander es gibt genug Platz zum Ablesen der DNA Transkriptionale Regulation (während der Transkription) Sie beeinflusst, wie häufig ein Gen abgelesen wird (Transkriptionsrate). Sie wird durch die spe- ziellen Transkriptionsfaktoren beeinflusst: - Proteine (Allgemeines Transkriptionsfaktoren) binden an den Promotor RNA-Polymerase bindet sich daran Enhancer und Silencer sind DNA-Abschnitte, die viele Basenpaare neben den Transkriptions- starts sitzen -> bestimmen, ob das Gen öfter oder weniger abgelesen werden muss - Aktivatoren oder Repressoren (spezielle Transkriptionsfaktoren) werden gebildet -> Aktivatoren sitzen am Enhancer Repressoren sitzen am Silencer sie müssen Polymerase binden = dies geschieht durch die Schleifenbildung die DNA wird so gebogen, dass die Transkriptionsfaktoren direkt an die Polymerase binden können Enhancer beschleunigen die Transkriptionsrate (Gen kann öfters abgelesen werden) Silencer senken die Transkriptionsrate (Gen kann seltener abgelesen werden) Epigenetik Die Epigenetik ist eine Teilrichtung der Genetik. Sie beschäftigt sich mit der Beeinflussung der Umwelt der Genaktivität. Zwillingsforschung Forschende haben immer wieder an eineiigen Zwillingen geforscht, denn Zwillinge sind genetisch identisch. Bei ihnen lassen sich genetische Unterschiede besonders gut erkennen. Bei älteren Zwillingen findet man einige epigenetische Unterschiede, das bedeutet, dass bei einem Zwilling, Gene angeschaltet waren, die beim anderen abgeschaltet waren (durch Umwelteinflüsse und Erfahrungen). Der Grund Die Regulierung der Genaktivität ist ein wichtiger evolutionärer Mechanismus. Organismen müssen zum Überleben ständig auf ihre Umwelt reagieren und der Körper muss sich an schwankende Umwelteinflüsse anpassen. Einflüsse wie Ernährung, Stress, Bewegung, Anhaltende Gefühlslagen können das An- und Ab- schalten von Genen zur Folge haben. Diese epigenetischen Veränderungen könnten dann auch weitervererbt werden! Interferenz und Gen-Silencing Mit RNA-Interferenz bezeichnet man eine Unterbrechung bei der Übersetzung (Translation) der mRNA in ein Protein. Es handelt sich hier also um eine Form der Genregulation, indem ein bereits transkribiertes Gen nicht oder nur in geringem Umfang in ein Protein umgesetzt wird (Gene-Si- lencing). Mutation Eine Genmutation ist eine Veränderung der Erbinformation innerhalb eines Gens durch Veränderung in der Basensequenz. Die Genmutationen Stumme-, Punktmutation Austausch einer o. mehrerer Basen in einem bestimmten DNA-Abschnitt, jedoch führt es zu keinen Auswirkungen, da die Aminosäure gleich bleibt und das Protein sich nicht verändert. 9.3. WWW NAN AAA AAA MMM MAM AAA AAA Phe Tyr Glu Glu Missense Mutation Austausch einer o. mehrerer Basen in einem bestimmten DNA-Abschnitt, wodurch an dem Codon eine andere Aminosäure eingesetzt wird (anderes Protein). Die Rastermutationen Insertion Einbau einer o. mehrerer Basen in einem bestimmten DNA-Abschnitt. Ab dem Punkt der Mutation führt es zu einer Verschiebung der restlichen DNA-Sequenz, dadurch ändert sich die Folge der Aminosäuren und die Struktur des Proteins und es könnte evtl. funktionslos werden. WWW WAU DAN WAN MMM MAM AAA AGA શનિ વિવિ Chromosomenmutation लाल बच बाचाच बाचाब MMM MAN GAA GAA Phe Tyr Glu Glu Nonsense Mutation Austausch einer o. mehrerer Basen in einem bestimmten DNA-Abschnitt, wodurch an dieser Stelle ein Stop Codon entsteht - führt zu einem nicht funktiosfähigen Protein (Protein ist nicht vollständig) 8.8. WWW WWW MMM MAA UAA -> Stop Codon NOW NAU HAN HAD MMM MAM AAA AAA DE Deletion Entfernung einer o. mehreren Basen in einem bestimmten DNA-Abschnitt, dadurch ändert sich die Folge der Aminosäure und die Struktur des Proteins. Evtl. Funktionsloses Protein, weil es ab dem Punkt der Mutation für ein Aufrücken der restlichen DNA-Sequenz einer Base führt. MMM AMG AA AGG Die Chromosomenmutation betrifft einzelne Teile des Chromosoms, dadurch wird aber die Gesamtstruktur des Chromosoms verändert. Man unterscheidet zwischen fünf Formen: Deletion Ein Stück des Chromosoms geht verloren Duplikation Verdoppelung eines bestimmten Abschnitts eines Chromosoms Insertion Ein zusätzliches Chrom- osomenstück wird ein- gefügt Stammbaumanalyse Rezessiver Erbgang ▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬ - ▬ M Inversion Herausgebrochene Chromosomenabschnitte können -> umgekehrt wieder eingebaut werden Translokation Teilstücke aus anderen Chromosomen können sich anlagern Wenn es mehr oder weniger Chromosomen gibt kann es zu Trisomie 21 (Durchschnittliche Chromosomen 46) Frauen xx Homozygot Allele sind gleich (AA, aa) Heterozygot Dominanter Merkmal tritt in jeder Generation auf Erbgang kranke Eltern haben auch gesunde Kinder meist vollständige Penetranz des Merkmals - mindestens ein Elternteil Heterozygot / Homozygot für das Merkmal Männer xy gleichartig Allele sind unterschiedlich (Aa) -> verschiedenartig Homozygot dominant: AA Homozygot rezessiv: aa Heterozygot: Aa Der Großbuchstabe ist je- weils das dominante Allel. bei Ausprägung des Merkmals werden Generationen übersprungen gesunde Eltern haben auch kranke Kinder Genotyp muss nicht ausgeprägt sein Analyse von Erbgängen Überprüfung der Merkmalsausprägung der Mitglieder der betroffenen Familie über mehrere Generationen -> auf Basis der gewonnenen Daten wird ein Stammbaum erstellt -> dazu werden bestimmte Symbole verwendet zunächst wird geklärt, ob eine dominante oder rezessive Vererbung vorliegt - ist das Allel für ein Merkmal dominant, reicht die Anwesenheit eines Allels aus, um das Merk- mal zur Ausprägung zu bringen -> Geterozygotie -> Mischerbig, 2 verschiedene Allele für ein Gen - die Information eines rezessiven Allels kann nur im Fall der Homozygotie in Erscheinung treten -> reinerbig, 2 identische Allele für ein Gen ob ein Allel rezessiv oder dominant ist lässt sich erkennen, wenn beide Elternteile den gleichen Phänotyp aufweisen, ein Kind jedoch phänotypisch von den Eltern abweicht Genosomale Erbgänge Allele werden abhängig vom Geschlecht vererbt -> nur einem Geschlecht wird es weitervererbt -> beide Eltern krank, Kind gesund => kann nur dominant sein beide Eltern krank, Kind gesund Merkmal kommt in jeder Generation vor => Dominant Krank: Aa / AA Gesund: aa Aa Beispiele aa Männer & Frauen sind in etwa gleich häufig betroffen aa Autosomal aa aa aa Aa Rezessiv beide Eltern gesund, Kind krank Aa Aal aa Muss nicht in jeder Generation vorkommen Krank: aa Gesund: Aa / AA Aa Aa -> 2 gesunde Eltern, Kind krank => kann nur rezessiv sein aa AA (AA) Aa AA Aal aa Aa Autosomale Erbgänge Allele werden unabhängig vom Geschlecht vererbt Statistisch mehr Frauen krank Dominant Vater krank, Mutter gesund -> alle Töchter betroffen, Söhne nie Vater Mutter Tochter Sohn aa Frauen: 75% Männer: 50% Aa Gonosomal ХУ XX XX XX xy - Rezessiv Statistisch mehr Män- ner krank Frauen Können Kon- duktoren sein OOD xy ХУ XX XX / XX Gesund: Aa AA Krank: aa Autosomal Rezessiver Erbgang -> Generation wurde über- sprungen und gesunde Eltern können auch kranke Kinder bekommen aa aa 656 Gelektrophorese aa Aa Elektrode aa Gel aa aa Aa aa Elektrode Eine Gelektrophoreseapparatur besteht im wesentlichen aus einer Gel- matrix, die von Molekülen durchwandert werden kann. Das Gelmatrixfeld wird elektrisch aufgeladen, eine Seite ist negativ und die andere Seite ist positiv geladen. aa Gesund: aa Krank: Aa AA Ablauf das Gel stellt ein dreidimensionales Sieb dar, in welchem sich unterschiedlich große Moleküle mit verschiedenen Geschwindigkeiten bewegen DNA-Abschnitte werden mit PCR vervielfältigt das Gemisch wird ins Gel (ist in einer Salzlösung) pipettiert und durch Elektroden wird ein elek- trisches Feld aufgebaut Nukleotide sind an der Phosphatgruppe negativ geladen (bewegen sich im Gel zur positiven Elektrode) - Genosomal Dominanter Erbgang -> tritt in jeder Generation auf und kranke Eltern haben auch gesunde Kinder kleine Fragmente bewegen sich durch das Gel schneller als die großen, also es erfolgt eine Auftrennung der DNA-Fragmente entsprechend ihrer Länge die unterschiedlich lange Fragmente liegen nach der Auftrennung in Banden vor - lässt man ein Gemisch mit DNA-Abschnitten bekannter Größe durch das Gel laufen, kann man die Größen der aufgetrennten Molekülen bestimmen -> sichtbar werden sie durch fluoreszierende Substanzen oder radioaktive Markierungen DNA-Fragmente Pufferlösung Trennung im elektrischen Feld Ziel: Trennung & Bestimmung unterschiedlich langer DNA-Abschnitte Geldtasche Sequenzierung = Feststellung der Basenfolge in einem bestimmten DNA-Abschnitt (Fragment) + Ablauf einsträngige DNA-Matrize wird mit Nucleotiden und DNA-Polymerase in 4 Sequenzieransätze gegeben -> komplementäre Anlagerung von Nucleotiden an den Matrizenstrang neben normalen Nucleotiden befindet sich in den Ansätzen auch I radioaktiv markiertes Nuc- leotid (veränderte Struktur) solange normale Nucleotide anlagern, wird die DNA-Synthese fortgesetzt nach Einbau des radioaktiv markierten Nucleotids (Desoxy-Nucleotid) bricht die Synthese ab, da am 3. C-Atom kein weiteres Nucleotid binden kann -> im Sequenzieransatz entstehen unterschiedlich lange DNA-Ketten, die mit einem bestimmten radioaktiv markierten Nucleotid enden die 4 Sequenzieransätze werden durch Gelektrophorese aufgetrennt - Bandenmuster des Gels entspricht der Nucleotidsequenz des synthetisierten Strangs der unbekannte Matrizenstrang muss komplementäre Nucleotidsequenzen Genetischer Fingerbadruck Fragmentierung von DNA Analyse DNA mit passenden Restriktionsenzyme geschnitten & analysiert unterschiedlich große Restriktionsfragmente auf Basensequenzunterschiede im Bereich der Schnittstelle zurück (bei manchen Personen kann Restriktionsenzym die DNA nicht mehr scheiden) - hohe Anzahl von Schnittstelle = individuelle Zusammenstellung der DNA-Teilstücke (Fragmente) Gelektrophorese - Analyse repetitiver Sequenzen Analyse nicht in für Proteine codierenden DNA-Abschnitten des Genoms (Exons), sonde in den Introns -> in Introns werden bestimmte Sequenzen häufig wiederholt (repetitive Sequenzen) Unterscheidung nach Länge & Häufigkeit in Mini- & Mikrosatelliten bei Minisatelliten wird eine Sequenz von 5 bis 50 Basenpaaren etwa 10 bis 100mal wiederholt - bei Mikrosatelliten wird eine Sequenz von 2 bis 4 Basenpaaren etwa 5 bis 15mal wiederholt -> werden häufiger untersucht - DNA-Sequenzierung (Kettenabbruchmethode) Die Kettenabbruchmethode nach Sanger ist ein wichtiges Analyseverfahren. Sie wird angewendet, um zum Beispiel Erbkrankheiten zu diagnostizieren und auch bei der DNA-Klonierung. Mit Hilfe der DNA- Sequenzierung kann eine Nucleotid-Abfolge in einem DNA-Molekül bestimmt werden. Die ersten Schritte laufen wie die PCR ab: Zuerst wird die DNS denaturiert um Einzelstränge zu erhalten. Anschlie- Bend findet die Hybridisierung statt, wobei jedoch nur ein Primer angelagert. Dadurch wird bei der darauffolgenden Synthese immer nur von einem Strang ein komplementäres Gegenstück hergestellt. Zusätzlich werden zu den vier Nucleotiden noch vier Abbruchnucleotide eingesetzt, weile ein verän- dertes Zuckermolekül enthält, was am 3'-C-Atom keine OH-Gruppe mehr besitzt. Wegen dieser feh- lenden OH-Gruppe können Abbruchnucleotide nicht mit der Phosphatgurppe des nächsten Nucleotids verknüpft werden. Dadurch ist keine weitere Kettenverlängerung möglich. Dort bricht die Reaktion ab. Die daraus resultierenden vier Nucleotide sind floureszensmarkiert. Danach werden die DNS-Nucleo- tide durch eine Elektrophorese der Größe nach aufgetrennt. Durch einen Laser werden anschließend die jeweiligen Basensequenzen bestimmt.