Gentechnik

Alternativer Bildtext:

Schnitten: O Schnitt in der Mitte der Sequenz: es entstehen glatte Enden O versetzter Schnitt: klebrige Enden O Herstellung eines rekombinanten Plasmids mithilfe von Restriktionsenzymen und Ligasen: 1. Isolierung und Bearbeitung der Fremd-DNA: Zerschneiden der DNA mit dem Restriktionsenzym 2. Isolierung von Plasmiden aus Bakterienzellen und Aufschneiden der Plasmide mit dem gleichen Restriktionsenzym, das zum zerschneiden der Fremd-DNA genutzt wurde ● 3. Hybridisierung: ● kohäsive Enden von Fremd-DNA und Plasmid sind komplementär zueinander Die Fragmente der Fremd-DNA werden mithilfe der Ligase in das Plasmid integriert bzw. Eingebaut, indem Elektronenpaarbindungen aufgebaut werden ✔ Plasmid ist nun rekombinantes DNA-Molekül (Hybrid-Plasmid) DNA bakterielles Plasmid O Restriktionsschnittstelle T GAATTC CTTAAG 1 Ein Restriktionsenzym zerschneidet das Zucker/ Phosphat-Gerüst an den durch Pfeile bezeichneten Stellen Karina Volinski G CITAA Zugabe eines DNA-Fragments aus einer anderen Quelle; Basenpaarungen der Einzel- strangüberhänge können in verschiedenen Kombinationen auftreten 3 DNA-Ligase verknüpft die Stränge kovalent rekombinantes | Plasmid AATIC G 3' 5' GAATT C CTTAA G 5' 3' eine mögliche Kombination 1 von 1 5' Einzelstrangüberhänge (kohäsive Enden") 5' AATTC G 5 Fragment eines anderen. DNA-Moleküls, das mit dem gleichen Restriktionsenzym geschnitten wurde rekombinantes DNA-Molekül 3' 5' GAATT C CTTAA G 5' 3" [G CTTAA 5 Bio LK DNA-Klonierung/ Selektion transgener Bakterien Anwendung DNA-Klonierung: Gewinnung und Vervielfältigung genau definierter DNA- Abschnitte (Herstellung vieler Kopien 1 Gens) Ergebnis: Es entstehen transgene Organismen, die durch DNA-Klonierung vermehrt werden und Markergene tragen Klonierungsansätze: Akteure: Benötigt: Technik: ● Restriktionsenzyme Ligase O Fremd-DNA Plasmid (Vector) a) Zuerst werden rekombinante DNA-Moleküle bzw Hybrid-Plasmide synthetisiert (wie oben beschrieben): man isoliert Plasmid aus Bakterienzelle O Fremd-DNA wird in bestimmte Stelle der Plasmid-DNA integriert Entstehung von Hybrid-Plasmid b) Transformation: Hybrid-Plasmid wird in eine fremde Zelle, meist Bakterienzelle, eingeschleust c) Vermehrung: Bakterienzelle vermehrt sich und bildet Zellklone aus rekombinanten Bakterien. (DNA-Klonierung) d) Plasmide werden ebenfalls repliziert und an Nachkommen weitergegeben Restriktion Ligation rekombinierte Plasmide Plasmid Transformation Vermehrung Wirtszelle Zelle Kolonie einer transformierten Karina Volinski (O 0° Fremd-DNA Bio LK Problem: Transformation nur in wenigen Fällen erfolgreich, daher: Selektion transgener Bakterien durch das Prinzip der Markerinaktivierung . ● aus Transformation gewonnenen Bakterien werden auf Antibiotika enthaltenden Nährboden gesetzt. Die Bakterien, mit dem Markergen ( Antibiotikaresistenzgen) können sich vermehren und Kolonien bilden Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Polymerasekettenreaktion - PCR zu replizierende Original-DNA Nucleotid kein Plasmid DNA- Primer Vermehrung der Bakterien mit Hybrid-Plasmid Denaturierung (Schmelzen) bei ca. 96°C 2 Primerhybridisierung (Anlagerung) bei ca. 68°C 3 Elongation (Verlängerung) bei ca. 72 °C Karina Volinski Vektor-Plasmid O Bakterien ohne Hybrid-Plasmid: Empfindlich gegenüber Antibiotika 1+2 und färben sich blau, weil sie X-Gal hydrolysieren. Bakterien mit Plasmid ohne Fremd-DNA: Resistent gegen Antibiotika 1+2 Nähr- boden Bakterien mit Hybrid-Plasmid (transgene Organismen): bleiben weiß, weil sie das X-Gal nicht spalten können Sie sind empfindlich gegenüber Antibiotika 1, resistent gegen Antibiotika 2. Durch Stempel-Technik bzw. Replika-Plattierung werden die Bakterien vom ersten zum zweiten Nährboden übertragen. Hybrid-Plasmid mit Ampi- cillin Anwendung/Ziel: zyklische, direkte, gezielte Vervielfältigung eines definierten DNA- Fragments in einer kurzen Zeitspanne (In-vitro-Amplifikation) O O O Ergebnis: Nach 3 Zyklen entspricht 1/4 aller synthetisierten doppelsträngigen DNA-moleküle in der Länge genau der Zielsequenz. Nähr- boden mit Tetra- cyclin Bio LK PCR-Ansatz: Akteure: Benötigt: ● ● PCR-Verfahren: ● ● ● o hitzeresistente DNA-Polymerase (Taq-Polymerase) (gewonnen aus dem in heißen Quellen lebenden Bakterium Thermus aquaticus) 2 Primer (Ansatzpunkt für DNA-Polymerase) 4 DNA-Nucleotide (Desoxynucleosidtriphosphate) doppelsträngige DNA (Ausgangs-DNA) Apparat, in denen die PCR ablaufen, nennt man Thermocycler Voraussetzung für PCR: teilweise bekannte Basensequenz 3 verschiedene Schritte in zyklischer Folge wiederholt führt zur exponentiellen Vervielfältigung (Verdoppelung) identischer DNA-moleküle 1. Denaturierung: O Doppelstrang-DNA wird auf 90° O erhitzt O Dabei trennen sich die beiden Einzelstränge voneinander Einzelstränge dienen als Matrize für folgende DNA-Synthese 2. Hybridisierung: O Abkühlung der Einzelstränge auf 50⁰-60° 2 Primer binden sich an die jeweils komplementären Sequenzen der DNA- Einzelstränge 3. Amplifikation: O I am 3'-Ende der beiden Primer synthetisiert die Taq-Polymerase bei 72° mithilfe der im Ansatz vorhandenen Nukleotide einen komplementären DNA-Strang Zyklus 1: Es entstehen 2 Moleküle. Zyklus 2: Es entstehen 4 Moleküle. Zyklus 3: Es entstehen 8 Moleküle; zwei der Moleküle (weiß unterlegt) entsprechen in der Länge exakt der gesuchten Zielsequenz. genomische DNA Denaturierung: kurzzeitiges Erhitzen zur Trennung der DNA-Stränge Hybridisierung: langsames Abkühlen zur Anlagerung der Primer über Wasser- stoffbrückenbindun- gen an ihre komple- mentären Sequenzen auf der Ausgangs-DNA Extension: Verlänge- rung der Primer durch Anknüpfen von Nucleotiden an die 3'-Enden mithilfe der DNA-Polymerase Karina Volinski wwwwwmmm www Primer Zielsequenz neu eingebaute Nucleotide Verdopplung der DNA-Menge nach jedem Zyklus-Durchlauf (In-Vitro-Replikation) w Bio LK Gelelektrophorese Anwendung/Ziel: Unterschiedlich lange Moleküle trennen sich ihrer Größe nach in einem elektrischem Feld (Untersuchung von DNA-Molekülen) Ergebnis: verschiedene Bandenmuster, die Moleküle gleicher Länge und molekularer Masse enthalten Aufbau: . Gel Ablauf: ● ● ● ● Anode (Pluspol - Reduktion) Annahme von e- Kathode (Minuspol - Oxidation) Abgabe von e- Träger- und Trennsubstanz zwischen Kathode und Anode: dünne Gelplatte (z. B. Agarose oder Polyacrylamidgel) Das Gel wirkt als molekulares Sieb, O in dem Nukleinsäure- oder Proteinmoleküle nach ihrer Größe, der elektrischen Ladung oder anderen physikalischen Eigenschaften voneinander getrennt werden Nukleinsäuren (DNA-Stücke) sind wegen ihrer Phosphatgruppe negativ geladen u. wandern in einem angelegten elektrischen Feld von Kathode zur Anode In der Gelphase behindert die Matrix des Gels große Moleküle stärker als kleine O daher legen kürzere Fragmente in einer bestimmten Zeit eine größere Strecke im Gel zurück als längere O es entstehen Trennungen nach olmasse bzw. Moleküllänge Zur Bestimmung der Länge des DNA-Stücks lässt man Kontroll-DNA-Stücke (Größenmarker) mitlaufen → zur Identifikation der DNA-Fragmente ist ein Längenstandart nötig Es entstehen Banden, die Moleküle gleicher Länge und molekularer Masse enthalten Sichtbarmachen des Bandenmuster über Fluoreszenzfarbstoff oder Autoradiografie (markierende radioaktive Stoffe) Glasplatten Gemisch von Molekülen unterschiedlicher Größe Strom- Quelle Gelelektrophorese 3 TROME unsichtbar kürzere Moleküle längere Moleküle TEILTE Karina Volinski gefärbtes, fertiges Gel Zsmfassung Gelelektrophorese: . Das Verfahren der Gelelektrophorese trennt Makromoleküle auf der Grundlage der Wandergeschwindigkeit durch ein Gel bei angelegter elektrischen Spannung. Die Strecke, die ein DNA-Molekül dabei zurücklegt, ist umgekehrt proportional zu seiner Länge Es entstehen Bandenmuster jede Bande enthält Moleküle derselben Länge Bio LK DNA-Sequenzierung Anwendung/Ziel: Analyse von DNA-Fragmenten zur Ermittlung der Besensequenz Ergebnis: Ein Satz mit DNA-Strängen, die mit den 4 unterschiedlichen ddNTPs enden und anhand dessen man die Ursprungssequenz analysieren kann Ansatz: Akteure: Benötigt: . ● 4 dNTP (,,normale" Nukleotide Desoxynukleotide) 4 ddNTP (Kettenabbruch-Nukleotid; chemisch abgewandelter Nukleotid) DNA-Polymerase Primer DNA-Matrize Kettenabbruchmethode (DNA-Sequenzierung nach Sanger): modifizierte DNA-Replikationsreaktion, die zu unterschiedlich langen, farblich markierten Fragmenten führt. 1. Denaturierung: zu sequenzierende DNA-Molekül wird denaturiert (aufgespalten) und in ein Einzelstrang getrennt o geschieht in einem Reagenzglas mit allen nötigen Reagenzien zur DNA-Synthese (siehe Akteure) zu 2. Hybridisierung: Anlagerungen eines Primers als Startsequenz für die Replikation O Damit passender Primer hergestellt werden kann muss Anfangsabschnitt der DNA bekannt sein Synthese aller neuer Stränge beginnt am 3'-Ende des eingesetzten Primers, weil die Synthese in 5'-3'-Richtung läuft Synthese mit dNTPs setzt sich fort bis zufällig ein ddNTP eingebaut wird O diese lässt keine weitere Kettenverlängerung DNA (Matrizenstrang) DNA ddC (Matrizenstrang) Primer T-3 Wanderungs- richtung der Moleküle T- 5' DNA- Polymerase Laser kürzestes Fragment ddG letzte Base des längsten markierten Molekülstranges Karina Volinski letzte Base des kürzesten markierten Molekülstranges ddA- Desoxyribo- nucleosidtri- phosphate dATP dCTP dTTP dGTP AUTGAAGU markierte Molekülstränge ddA- OH ddG längster markierter Molekülstrang G ddT- Detektor kürzester markierter Molekülstrang Didesoxyribonucleosid triphosphate (fluoreszenzmarkiert) ddATP ddc- ddCTP ddTTP ddGTP ddA ddG- längstes Fragment Bio LK Aufbau von ddNTP ist identisch zu dNTP bis auf das Fehlen der Oh-Gruppe am 3'- Kohlenstoffatom der Desoxyribose Der Einbau eines ddNTP führt zu einem Kettenabbruch, da die OH-Gruppe am 3¹- Kohlenstoffatom der Desoxyribose fehlt → ist der Anknüpfungspunkt für das nächste Nukleotid O verhindern das weitere Wachstum der Kette, dadurch entstehen unterschiedlich lange Fragmente, die mit unterschiedlich farbig markierten ddNTPs enden Trennung der DNA-Fragmente erfolgt durch Elektrophorese entweder durch Kapillarelektrophorese oder hren Gelelektrophorese O dabei werden Fluoreszenzfarbstoffe mit Laser sichtbar gemacht o computergestützte Detektoren ermitteln aus Abfolge der Farben die gesamte DNA-Sequenz Vergleich der Identifizierungsmethoden: Kettenabbruchmethode und Kapillarelektrophorese: Zahl der Ansätze 4 für die Sequenzierung Art der Markierung Radioaktiver Phosphor Markierte Bestandteile Elektrophoresenverfa Gelelektrophorese Zahl der Laufstrecken Primer Sichtbarmachung des Musters 4 U 4 MATP P Mg WHgn 1 LIT LITHIO www human Übersetzen in di Basenfolge Direkte Farbmarkierung Abbruchnukleotide nnnnnn? Kapillarelektrophorese TACCGTCATAGGCCGT Karina Volinski Radioaktiv markierte Primer Laser-Detektor detektiert machen per Autoradiographie auf die Farbsequenz und Röntgenfilm jede damit die Abbruchfragmentbande sichtbar Endbasensequenz 4 Kapillarelektrophorese Strangtrennung & Auftrennung nach Größe ATCAGCTO 1 Primer Detektor T OnnnnnOnni Fluoreszierende Farbstoffe MAMO Kapillarelektrophorese Laser-Detektor detektiert die Farbsequenz und damit die Endbasensequenz Laser Bio LK Elektrophorese Trennung nach Molekülgröße und -ladung Nucleotide (radioaktiv markiert) A G 16 Q C C GIA A G TG C HO C Sequenzierung A C GCTT CACG 90 C ODNA-Polymerase Primer G G BD BD G T Gesuchte Sequenz Die DNA-Polymerase synthetisiert verschieden lange DNA-Abschnitte mit der gesuchten komplementären Sequenz Komplementäre Sequenz (radioaktiv markiert) Terminatoren für A, C, G und T Reaktionsgefäße Bruchstücke, die mit einem bestimmten Nucleotid enden A0AA0000 GCACTTCG 0000 komplementäre gesuchte Sequenz Sequenz Leserichtung Zsmfassung DNA-Sequenzierung: Karina Volinski Denaturierung Hybridisierung mit dem passenden Primer Replikation: O Im Replikationsansatz sind neben dNTPs auch ddNTPs vorhanden, die den O O Kettenabbruch bewirken es entstehen unterschiedlich lange, terminal markierte DNA- Stränge die werden entweder in Gelelektrophorese oder Kapillarelektrophorese identifiziert 0 damit wird die Besensequenz ermittelt Bio LK Genetischer Fingerabdruck Ziel/Def: Identifizierung einer Person anhand des Vergleichs polymorpher Bereiche (DNA- Abschnitte ohne genetische Information) DNA-Profil eines Individuums Anwendungsbereich: ● Kriminaltechnik Vaterschaftstests Verwandtschaftsbeziehungen Methoden: ✓ VNTR-Polymorphismus Prinzip ✓ RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) ✓ STR (Short Tandem Repeats) STR Systeme, mit dem spezifische DNA-Seu O wenn wenig Analysematerial zur Verfügung steht a) PCR-Methode → künstliche Vervielfältigung der DNA b) Gewinnung der DNA durch Restriktionsenzyme ✓ RFLP O O O Karina Volinski Methode zur Ermittlung des genetischen Fingerabdrucks Gewinnung von DNA-Fragmenten mithilfe der Längenanalyse nicht codierender DNA- Bereiche (Introns) Bildung von DNA-Restriktionsfragmenten durch Schneiden der DNA-Proben mit dem selben Restriktionsenzymen um so mehr Restriktionsfragmente vorhanden sind, um so genauer die Analyse Identifizierung nach dem VNTR-Polymorphismus Prinzip O Verwendung nicht codierender Bereiche Verwendung von VNTRs: Repetitive Sequenzen (VNTR) sind kurze charakteristische Nukleotidsequenzen, die sich vielfach wiederholen . die variablen Wiederholungseinheiten liegen in den Extragenen, nicht codierenden DNA-Abschnitt auf Chromosomen c) Gelelektrophorese VNTRS sind als genetischer Fingerabdruck geeignet, weil sie individuell verschieden sind Sichtbarmachen der Fragmente/ Banden durch Sonden Anordnung mit der zu testenden Person vergleichen → Täter oder nicht Täter? Bio LK Marker Verdächtige CD مان Gensonden/DNA-Chips Tatort - Marker Basen- Anzahl -12000 -5000 -2000 -1650 -1000 -500 - -100 DNA-Chips: gentechnische Verfahren Zusammenfassung genetischer Fingerabdruck: Methoden: 0 O STR PCR VNTR-Polymorphismus Prinzip → RFLP DNA-Isolierung: O Probe A: aus dem vorhandenen Material O Probe B: von den zu testenden Personen DNA-Vervielfältigung mittels PCR Gewinnung der DNA durch Restriktionsenzyme Bildung von DNA-Restriktionsfragmenten durch Zerschneiden der DNA beider Proben mit dem glei Restriktionsenzymen Gensonden: DNA-Fragmente, die zu 100% mit einer Besensequenz übereinstimmen Gelelektrophorese zur Identifikation VNTR: repetitive Sequenzen mit variablen Wiederholungseinheiten in Extragenen, nicht codierenden DNA- Abschnitten sind individuell verschieden Karina Volinski Ziel/Anwendung: kann z.B. feststellen welche der untersuchten Gene in einem bestimmten Gewebe zu einer bestimmten Zeit exprimiert werden Verfahren: a) Auf DNA-Chip aus Glas oder Kunststoff werden spezifische DNA-Sonden fixiert b) Aus Zellen des zu untersuchenden Gewebes wird mRNA gewonnen und mit Reverse Transkriptase in DNA umgeschrieben entsteht cDNA c) entstandene cDNA wird mit Fluoreszenzfarbstoff markiert und auf den Chip gegeben d) cDNA hybridisiert mit eventuell vorhandenen komplementären DNA-Sonden e) nicht gebunden cDNA wird abgespült f) anhand der Fluoreszenzstrahlung kann ermittelt werden, welche Gene im untersuchten Gewebe exprimiert wurden Blut- oder Speichelproben liefern Zellen, aus denen DNA gewonnnen wird O ↑ gebundene DNA- Fragmente senden Lichtsignale aus: je mehr gebunden ist, desto heller der Punkt auf dem Genchip son jede Sonde erkennt ein anderes Gen kleine DNA-Fragmente werden mit einem Farbstoff markiert. die markierte DNA bindet an Sonden auf dem Genchip Ⓒwissensschau.de Bio LK Gewinnung von Spender-DNA → cDNA Anwendung: Mithilfe Enzyms Reverse Transkriptase kann aus isolierter mRNA das entsprechende Gen gewonnen werden benötigt: . . Reverse Transkriptase Primer . DNA-Nucleotide Verfahren: Reverse Transkriptase synthetisiert komplementären DNA-Strang beiden Stränge des mRNA-DNA-Hybridstrangs werden voneinander getrennt mRNA-Strang wird abgebaut DNA-Polymerase ergänzt den DNA-Einzelstrang zum Doppelstrang die entstandene DNA wird cDNA (copy-DNA) genannt 5' reverse Transkriptase + dNTPs verbleibende kleine DNA- Fragmente 5' 3₁ 5' 3' Teilverdau durch RNase H 5' 3' DNA-Polymerase + dNTPs Karina Volinski 5⁰ 3' 5' 3' Ligase AAAAA 3' TTTTT 5' AAAAA 3' TTTTT 5₁ AAAAA 3¹ TTTTT 5' AAAAA 3¹ TTTTT 5' AAAAA 3' TTTTT 5' AAAAA 3' TTTTT 5' doppelsträngige cDNA Bio LK CRISPR/Cas9 Ziel/Anwendung: Alternative Bezeichnung: programmierte Genscheren ermöglicht es ein Genom sehr eindeutig und präzise an jeder gewünschten Stelle zu schneiden Ursprung: stammt aus Bakterien dient ihnen als Abwehrmittel gegen Bakterien Genom-Editierung : O Gene inaktivieren o Fremdgene in DNA-Sequenz einfügen Abwehrsystem der Bakterien gegenüber virulenter DNA: ● Erstinfektion: • ● Virus injiziert seine DNA in Bakterium Bakterien können injizierte virulente DNA zerschneiden und Fragmente in Genom einbauen → Spacer O eingebauten virulente DNA-Abschnitte im Genom nennt man SPACER Virus- Guide RNA Target DNA Virus-DNA mapa Cas-Gen Bakterien-DNA Repeat Karina Volinski Cas wwwvv Repeat Repeat Spacer Single guide RN Repeat Spacer + Repeats bilden zsm die CRISPR-DNA Bakterium besitzt durch Spacer ein ,,Archiv" über früher eingedrungene Viren → so kann das Genom bei 2-Infektion Virus schneller erkennen und zersetzen CRISPR-Gen besteht aus: - Spacer Repeats CRISPR assoziierten Sequenzen Cas codiert unter anderem für 1 Enzym, dass DNA schneidet Spacer CRISPR-DNA Spacer: - liegen im Genom der Bakterien zwischen Repeats (kurzen, wiederholenden Basensequenzen) WWW.VVV ||||| ||||| III Spacer Stem loop2 Bakterium Bio LK Zweitinfektion: ● . ● ● Reparaturmechanismen - Genom-Editierung ● bei 2-Infektion mit Virus, dessen DNA im Bakteriengenom archiviert ist, wird CRISPR- DNA codiert Aus prä-crRNA (unreife RNA der CRISPR- DNA) wird durch RNA-Prozessierung reife crRNA-Moleküle hergestellt. Doppelstrangbruch durch Cas ● ● unschädlich ● b+c) homologe Reparaturen: a) nicht-homologe Reparaturen: Gene werden abgeschaltet einzelne DNA-Nukleotide gehen häufig verloren → Deletion Leseraster ist in der Zielsequenz verschoben und damit Gen inaktiviert Cas-Enzym Cas-mRNA Cas-Gen B O unterscheiden sich in Spacersequenzen bakterielle Cas-Gene werden exprimiert Cas-Enzyme in der Bakterienzelle vorliegen Reife crRNA-Moleküle können sich mit Cas-Enzymen zsmlagern Wenn crRNA-Moleküle komplementäre Spacersequenz zu einigen Basensequenzen der injizierten Virus-DNA besitzt, bindet es daran und leitet Cas-Enzym gezielt an diese Stelle Cas-Enzym durchtrennt virale DNA O D.h. Doppelstrangbrüche erzeugt und virale DNA (Virus) ist für Bakterium Karina Volinski rrrr Prozessierung mmm rRNA prä- Transkription -SVAVAANVAVAVAVAVAVAVAVAVAVAVA CRISPR/Cas9 Fremdgene werden eingefügt homologe Sequenzen der Bruchstücke müssen zur Verfügung stehen in die DNA-Bruchstellen soll Fremdgen eingebaut werden O Fremdgen muss an den Enden Sequenzen besitzen, die homolog zu der DNA an der Bruchstelle sind gentechnisches Verfahren 1 Abwehrsystem der Bakterien. A Erste Infektion; B Zweite Infektion Leitfaden RNA CRISPR Die Gen-Schere CRISPR/Cas9 CRISPR/Cas-System Im Labor hergestelltes Werkzeug zur gezielten Veränderung des Erbguts ("Genome Editing") So funktioniert die Gen-Schere 1. Gezielter Schnitt XXX Leitfaden findet Ziel-DNA 90 reife crRNA ..Schere" Cas9 protein Schere" schneidet do DNA-Strang 2. Veränderung des Erbguts durch... A) Entfernen eines DNA-Abschnitts XXIIXXX -t B) Einfügen eines einzelnen DNA-Bausteins XNXX C) Einbau neuer DNA-Abschnitte Quelle: Forum Bio- und Gentechnologie/dpa/DW