Molekulargenetik

Alternativer Bildtext:

und Desoxyribose würde man streng genommen Desoxyadenosin nennen, häufig sagt man auch da trotzdem Adenosin • Guanin wird mit Ribose zu Guanosin • Mit Phosphat werden die Nukleoside zu Nukleotiden • sie heißen dann z.B. Adenosinphosphat (bzw. Desoxyadenosinphosphat) • Die Anzahl der Phosphate kann man mit ,,-monophosphat", ,,-diphosphat" und - triphosphat" angeben • Zucker und Phosphat sind über Esterbindungen verknüpft • Phosphate sind Anionen oder Ester der Phosphorsäure • In der DNA geht die Phosphatgruppe zwei Esterbindungen ein, da jede Phosphatgruppe mit zwei Zuckern verbunden ist • Die Zucker sind immer am 3. und am 5. C-Atom mit der Phosphatgruppe verbunden • Die Enden der DNA kann man daher in 5'-Ende und 3'-Ende unterscheiden OH 4 3 Base 2' 1' 5'-Ende Esterbindung NH₂ G NH -NH₂ H₂N H3C OH 3'-Ende ΝΗ Paarung der Basen • Beim Doppelstrang sind die Einzelstränge über Wasserstoffbrückenbindungen miteinander verbunden • Es paaren sich immer nur bestimmte Basen, die miteinander die Wasserstoffbrücken ausbilden können • Adenin paart sich immer mit Thymin und bildet 2 H-Brückenbindungen • Cytosin paart sich mit Guanin, sie bilden 3 H-Brückenbindungen • A und T und G und C bilden ein Basenpaar (komplementär) • in der RNA statt Thymin Uracil vorkommt, paaren sich dort Adenin und Uracil H OH-N T -N CH3 G OH N H H Information aus der DNA • Die Basenabfolge = Bauplan für Proteine • Hierfür wird die Basenabfolge der DNA in RNA abgeschrieben und die Information der RNA dann in die richtige Reihenfolge von Aminosäuren übersetzt, wodurch Polypeptide bzw. Proteine hergestellt werden können Aufbau der RNA • Kennt man den Aufbau der DNA, dann kennt man auch den Aufbau der RNA • Sie unterscheiden sich nur darin, dass in der RNA Uracil statt Thymin vorkommt und Ribose statt Desoxyribose • RNA nur einzelsträngig DNA-Replikation • Vor der Zellteilung muss die DNA repliziert (verdoppelt) werden, damit beide Tochterzellen die gesamte Erbinformation erhalten Theoretische DNA-Replikationsmechanismen ||| ||| semikonservativ konservativ dispers • Meselson-Stahl-Versuch > Replikation semikonservativ • die beiden neuen DNA-Doppelstränge sind jeweils aus einem alten Einzelstrang und einem neu gebildeten Einzelstrang zusammengesetzt • Jede Tochterzelle erhält dann einen Doppelstrang Nachweis Bakterien in Nährmedium gebracht, in dem bestimmtes Stickstoffisotop vorkam, welches in die DNA eingebaut wurde • Bakterien in ein Nährmedium mit einem anderen Stickstoffisotop gebracht • nach der ersten Zellteilung wurde die Dichte der DNA gemessen • Dichte war so, dass die Hälfte der DNA das eine Stickstoffisotop enthalten musste, die andere Hälfte das andere Stickstoffisotop • bei der Replikation müssen die Einzelstränge aufgetrennt werden, und an beiden Einzelsträngen dann ein neuer, komplementärer DNA-Strang gebildet wird • sicher gestellt, dass neue DNA genau die gleiche Basenabfolge wie die alte hat • Als erstes muss der verdrillte DNA-Doppelstrang entwunden werden und die Wasserstoffbrücken aufgetrennt, damit die getrennten Einzelstränge vorliegen • Topoisomerase entwindet die DNA • Helikase trennt die H-Brücken zwischen den Einzelsträngen auf • entstehende Formation = ,,Replikationsgabel" • Anlagerung der DNA-Polymerase (bildet an jedem Einzelstrang einen komplementären neuen Strang) • Sie kann den neuen Strang immer nur von 5' zu 3'-Ende synthetisieren, bzw. aus Sicht des alten Strangs von 3` zu 5` entlanglaufen 3 • Das führt dazu, dass die DNA-Polymerase an einem Strang (hier unten) kontinuierlich entlanglaufen kann (von links nach rechts), während die Helikase die Replikationsgabel nach rechts immer weiter öffnet, am anderen Strang (hier oben) die DNA-Polymerase aber immer nur von rechts nach links laufen kann, sie also bei einer weiteren Öffnung der Replikationsgabel rechts jedes DNA-Polymerase mal neu ansetzen muss. Folge- strang 5' 5' Leit- strang 3 DNA-Polymerase Helicase ← DNA-Polymerase ார் on. 5' Topoisomerase Helicase DNA-Polymerase 3' X₁ 5' Topoisomerase for Topoisomerase • Der Strang, an dem kontinuierlich repliziert werden kann, wird Leitstrang genannt, der andere Strang Folgestrang 3' Folge- strang 5' 5 XI 3' Leit- strang 3' Folge- strang Leit- strang • DNA-Pomyerase muss am Folgestrang während sich die Replikationsgabel nach rechts weiter öffnet immer wieder weiter rechts ansetzen und nach links laufen 3₁ • Dabei kann die DNA-Polymerase nicht ihren neu synthetisierten Strang mit den vorher synthetisieren Stücken verbinden, am Folgestrang wird der neue Strang also in Fragmenten gebildet (Okazaki-Fragmente) 3′ Folge- strang 5' A DNA-Polymerase Leit- strang K XN Okazaki-Fragmente DNA-Ligase DNA-Polymerase NA. 5' 3' Topoisomerase • DNA-Ligase verbindet Okazaki-Fragmente miteinander, indem sie die DNA- Rückgrate (aus Phosphat und Zucker) über Esterbindungen miteinander verbindet for 3₁ 5' Topoisomerase for 3₁ 5' Topoisomerase • Als Bausteine für die DNA-Polymerase dienen Nukleotide, die in der Umgebung herumschwimmen • Sie liegen als Triphosphate vor, also als Desoxyadenosintriphosphat (dATP), dTTP, dGTP und dCTP • Die Energie, die beim Abspalten der zwei Phosphatgruppen frei wird, wird für die Synthese der DNA genutzt • Die DNA-Polymerase kann den neuen Strang nicht einfach „frei“ anfangen, sondern braucht einen Anfang, den sie dann vervollständigt • Als Anfang dient ein Stück RNA, das von der Primase gebildet wird und RNA- Primer genannt wird 5' RNA-Primer RNA-Primer 00000 DNA-Polymerase • RNA-Primer werden später entfernt -> DNA-Polymerase kann Lücke auffüllen, die Ligase dann wieder das Rückgrat verschließen 5 alter Strang neuer Strang entfernter Primer • Aber auch zum Auffüllen braucht die DNA-Polymerase ein vorheriges Stück DNA oder Primer • Das führt dazu, dass beide neu synthetisierten Strän am Anfang, bzw. Ende ein Stück kürzer werden als der alte Strang, genau um eine Primerlänge RNA-Primer alter Strang neuer Strang 5' • Die Polymerase kann nur von 5 -> 3' synthetisieren • Um die Lücken aufzufüllen, müsste es einen Primer jenseits der DNA geben, damit die DNA-Polymerase das Stück vervollständigen könnte • Bei der nächsten Zellteilung ist der neue Strang dann einer der alten Stränge, der an ihm neu gebildete Strang wird so auch nochmal kürzer neuer Strang alter Strang • Bei jeder DNA-Replikation wird die neue DNA also ein Stück kürzer, es geht immer mehr verloren • Um dem entgegenzuwirken, gibt es an den Enden der Chromosomen (also an den Enden der DNA) die Telomere • DNA-Abschnitte aus sich repetitiven Basenabfolgen, die keine Erbinformation enthalten und so verloren gehen dürfen • Bei jeder Zellteilung geht also nur ein Stück der Telomere verloren • Die Länge der Telomere begrenzt damit auch die Lebenszeit einer Zelle • denn wenn die Telomere weg sind, wird bei jeder Zellteilung ein Stück der wichtigen, Erbinformation enthaltenden DNA abgeschnitten -> irgendwann Funktionsverlust und Tod • Zellen, die unbedingt die Fähigkeit haben müssen, sich unbegrenzt teilen zu können, umgehen dieses Problem durch das Enzym Telomerase, das die Telomere verlängern kann, indem sie DNA an die Enden anfügt • hat eigene Vorlage aus RNA, die sie in DNA umschreibt und anfügt Besonderheiten bei Prokaryoten • Die Topoisomerase heißt bei den Prokaryoten Gyrase • In fast allen Prokaryoten wie Bakterien ist das Chromosom ringförmig -> benötigen daher keine Telomere • DNA-Polymerase kann einmal komplett herumlaufen, ohne dass es zum Verlust von DNA kommt • Prokaryoten unterliegen daher keiner Zellalterung im Sinne von sich verkürzenden Telomeren DNA-Reperatur • Basenabfolge der DNA ist für korrekte Erbinformation sehr wichtig • Äußere Einflüsse (Radioaktive Strahlung, UV-Strahlung und chemische Einflüsse) und Fehler bei der Replikation können die Struktur der DNA und die Basenabfolge verändern ● Reparatur durch verschiedene Enzyme • Die Enzyme können dann Basenfehlpaarungen rückgängig machen • Einzelstrang- oder Doppelstrangbrüche der DNA reparieren • fehlerhafte Stücke aus der DNA herausschneiden (Excisionsreparatur) • Wenn die Schäden einer Zelle zu groß sind, wird die Teilung der Zelle angehalten und ggf. der programmierte Zelltod eingeleitet, um der Entstehung von Krebs vorzubeugen • Sind aber genau diese Mechanismen defekt, kann Krebs entstehen Transkription Proteinbiosynthese • DNA wird in RNA abgeschrieben • Hierfür RNA-Polymerase verantwortlich • Startbereich für die Transkription wird durch bestimmte Basensequenzen markiert = Promotor • Am Promotor kann dann die RNA-Polymerase ansetzen und eine Kopie von einem der DNA-Einzelstränge anfertigen Antisense strand RNA polymerase CTGÁCĠĠATCÁĠCCĠCÁÁG GGÅÅTTGGEGACÁŤÁÁ GACUGCCUAGUCGGCGUU RNA Transcript GACTGCCTAGTCGGCGTTCGCCTTAACCGCIGIATI Sense Strand • RNA-Transkript wird in der Proteinbiosynthese als Messenger-RNA (mRNA) bezeichnet • Die beiden DNA-Stränge kann man in Sense-Strang und Antisense-Strang unterscheiden • Die Basenabfolge der RNA ist komplementär zum Antisense-Strang (Anti- Sinn-Strang) und entspricht damit dem Sense-Strang (Sinn-Strang), abgesehen davon, dass in der RNA Uracil statt Thymin vorkommt • Die mRNA ist einzelsträngig • Die RNA wird genau wie in der DNA-Replikation von 5` -> 3¹-Ende gebildet • Die RNA-Polymerase benötigt keinen Primer • Die gebildete mRNA wird zunächst als unreife mRNA oder prä-mRNA bezeichnet (mit Introns und Extrons) • sie wird vor dem Verlassen des Zellkerns noch modifiziert (bei Eukaryoten, siehe Spleißen) Translation • Das Ribosom fährt mit seinen zwei Untereinheiten vom 5'-Ende zum 3¹-Ende an der mRNA entlang und klemmt diese dabei ein • Dabei werden immer 3 Basen der RNA auf einmal betrachtet, die für eine bestimmte Aminosäure stehen • 3 Basen werden als Basentriplett oder Codon bezeichnet • Die richtige Übersetzung ist im ,,genetischen Code" festgelegt • Zum Lesen des genetischen Codes ,,Codesonne" • Basenreihenfolge von innen nach außen, in der mRNA entspricht das 5'- zum 3'-Ende, also so, wie die mRNA synthetisiert wurde • Proteinbiosynthese beginnt immer mit dem Startcodon AUG Man landet bei der Aminosäure Methionin erste Aminosäure von der Zelle gebildeten Proteins 3₁ (A) Arg (R) Lys(K) (D) Asn (N) Gly (G) CHOCCHOUS C (3) U GU A A Thr GU C A C AGUCHOUC C UG Ser (S) UGACUG G Ua C 10100010 Cys (C) Trp (W) Pro (P) Leu Start Stop Genauer Ablauf am Ribosom • Ribosom liest die mRNA vom 5'-Ende ab • Am Startcodon AUG beginnt die Proteinbiosynthese • Transfer-RNAs (tRNAs) transportieren die Aminosäuren zum Ribosom • Damit sie die richtige Aminosäure abgeben, haben sie selbst ein Basentriplett, das als Anticodon bezeichnet wird • Eine tRNA, die eine bestimmte Aminosäure transportiert, hat auch immer ein bestimmtes Anticodon, das komplementär zum Codon für diese Aminosäure ist • So kann sich die tRNA an die mRNA anlagern und ihre Aminosäure abgeben TRNA Outgoing empty tRNA w Growing peptide chain Lys Asp) TRNA TRNA UUUCUA mm UGGA AGAUUUC Ribosome Phe Peptide Synthesis Incoming tRNA TRNA bound to Amino Acid bes 2 Translation MessengerRNA • Am Ribosom werden die Aminosäuren über Peptidbindungen miteinander verknüpft • Solange, bis ein Stopcodon kommt und das Polypeptid freigelassen wird • Die tRNAS haben eine schleifenähnliche Struktur Wachsendel Aminosäuren- Kette Peptidbindung Ribosom O Aminosäure tRNA Anti-codon Codon mRNA Der genetische Code ist... • universell -> für alle Lebewesen gleich • redundant/degeneriert -> Es gibt viel mehr Kombinationsmöglichkeiten im Basentriplett (insgesamt 64, 4*4*4) als Aminosäuren, für die die Codons codieren -> Der genetische Code codiert für 20 proteinogene (proteinbildende) Aminosäuren -> Dadurch gibt es mehrere Basentripletts, die für die gleiche Aminosäure codieren →> Häufig ist die letzte Base egal, nur die beiden ersten Basen entscheiden die Aminosäure • nicht überlappend -> jede Base ist fest einem Codon zugeordnet und jedes Codon steht für sich -> Es ist nicht so, dass die zweite Base eines Codons gleichzeitig die erste Base des nächsten Codons ist • Kommafrei -> Codons binden sich ohne Unterbrechung aneinander an • Eine 21. proteinogene Aminosäure (Selenocystein) kann bei einer bestimmten räumlichen Struktur der mRNA zusätzlich eingebaut werden • ein Gen ist für die Kodierung eines Polypeptids verantwortlich ● Polypeptide können Proteine sein und Proteine können Enzyme sein Chromosom elleee Jasadasasasasa Exon Intron Genom Exon Nukleosom DNA Gen . Ein Gen besteht aus Exons und Introns • nur Exons enthalten Information -> „codierende Abschnitte" • Die DNA wird „verpackt“, indem sie sich um Proteine wickelt (Histone) • Nukleosom = Einheit von 8 Histonen (1 Histonok tamer) und umwickelter DNA • Histone bestehen vor allem aus basischen Aminosäuren, sind daher häufig eher positiv geladen, weil sie ein zusätzliches H+ aufgenommen haben • DNA ist aufgrund der sauren Phosphatgruppen eher negativ geladen • Histone und DNA ziehen sich daher gegenseitig an, sind aber nicht kovalent aneinander gebunden • Chromatin = DNA und Proteine zusammen • Euchromatin: DNA recht locker" verpackt -> Gene können leicht abgelesen und Proteine so hergestellt werden • Heterochromatin: DNA dicht verpackt, man (stark kondensiert) -> DNA inaktiv, Gene können nicht abgelesen werden • In der Mitose liegt das Chromatin maximal kondensiert als Heterochromatin vor, einige Abschnitte können aber auch in der Interphase inaktiv sein und als Heterochromatin vorliegen. • Informationen, die nicht in der Basenabfolge der DNA gespeichert sind, sondern im Chromatin Epigenetik (De-)Methylierung • Methylgruppen werden an Cytosin-Basen gebunden -> Raumstruktur verändert (dichtere Verpackung der DNA) RNA-Polymerase kann nicht mehr an DNA binden -> Gene sind abgeschaltet ▶ • Methylierungsmuster wird bei Replikation an Tochterzellen weitergegeben • DNA und Histone können modifiziert werden, indem z.B. Phosphatreste, Methyl- oder Acetylreste angehängt werden -> Veränderung der Struktur des Chromatins und damit wie ,,locker" es vorliegen kann, was die Genaktivität beeinflusst • kann wieder rückgängig gemacht werden Diese Modifikationen werden an Tochterzellen weitergegeben ● Modifikation von Histonen Acetyl-/Phosphatgruppen werden an Histone gebunden ► lockeres Chromatin —> DNA kann abgelesen werden auch andersherum Zellkern Chromatin Transkriptions- faktoren Regulation der Chromatinstruktur Methyl- gruppe Nucleosom cleosom kooool DNA sejagaaaaa Methylgruppe Inaktivierung der DNA Histon DNA Histon- und DNA- Demethylierung Methylierung Histon- und DNA- xxxxxxxx Histon- Histon- Acetylierung Deacetylierung Aktivierung der DNA 6000000 I Acetyl- gruppe Histon-S Histon RNA-Polymerase mRNA Regulation der Proteinbiosynthese bei Eukaryoten Regelung der Genexpression hat bei Vielzellern die Funktion, viele spezialisierte Zellen zu entwickeln und ihre Tätigkeiten aufeinander abzustimmen +RNA) Gesamtheit der Gene werden unterteilt in: • nicht-protein-codierende Gene (enthalten Information für Bildung von rRNA, • protein-codierende Gene • Teil davon wird ständig exprimiert = Housekeeping-Gene o Expression der meisten wird reguliert oz.B. durch extrazelluläre Signalmoleküle B Signalmole- kül ist ein direkter Ak- tivator oder Repressor der Tran- skription. A Signalmolekül beein- flusst direkt ein Regu- lationsprotein. M Genom Signalmolekül beeinflusst indirekt ein Protein. 2 Drei Wege, über die ein extrazelluläres Signalmolekül die Genaktivität beeinflus- sen kann • Transkriptionsfaktoren (TF) o alle Proteine, die nach dem Schlüssel-Schloss- Prinzip in Wechselwirkung mit spezifischen DNA-Abschnitten treten und die RNA- Polymerase aktiviere oder hemmen werden durch Signalmoleküle (z.B. Hormone aktiviert) • DNA-Steuerelemente o regulatorische Abschnitte auf der DNA, an die TF binden (z.B. Promotor-DNA) • Summe der gleichzeitigen Einflüsse vieler TF entscheidet darüber, wo, wann und wie häufig ein Gen abgelesen wird • Regulation der Proteinbiosynthese durch Signaltransduktion sehr bedeutsam (z.B. Zellteilung, Wachstums- und Entwicklungsvorgänge, Regulation des Stoffwechsels) • mRNA-Prozessierung • Vorgänge nach der Transkription Eukaryoten haben Mosaikgene DNA Promotor- DNA DNA- prä- mRNA mRNA Transkriptionsfaktoren binden an die Pro- motor-DNA, die RNA- Polymerase wird da- durch aktiviert. Start- codon Exon 1 Ein Hormon aktiviert Transkriptionsfaktor. den Intron 1 -protein-codierendes Gen- MIN Exon 2 Transkription Spleißen zusammengefügte Exons Hormon Spleißstellen Exon 1 Intron 1 Exon 2 Intron 2 Exon 3, Transkriptionsfaktor Transkriptions- faktoren DNA-Steuer- elemente, u. a. Promotor-DNA mRNA- Polymerase Alternatives Spleißen • auch Exons können herausgeschnitten werden -> erhöht genetische Variabilität Intron 2 Exon 3 Aus der prä-mRNA werden die Introns durch Spleißen entfernt. Es entsteht die mRNA. b Transport aus dem Zellkern, Translation 1a) Modell der Regulation der Transkription; b) mRNA-Prozessierung herausge- schnittene Introns O enthalten codierende Bereiche Exons und nicht-codierende Bereiche Introns Spleißen • Introns werden aus der prä-mRNA herausgeschnitten • verbliebenen Exons zur mRNA verknüpft (wird anschließend translatiert) DNA | Transkription und Spleißen mRNA 1 Translation Exon 1 MMM Protein Intron 1 mRNA: 1. Möglichkeit Exon 2 Intron 2 Exon 3 FULLM Intron 3 Exon 4 Intron 4 Exon 5 mRNA: 2. Möglichkeit nos Ness NPS Protein 1 Protein 2 Protein 3 2 Modell zum alternativen Spleißen. Durch alternatives Spleißen können mit der Information eines Gens viele unterschiedliche Proteine gebildet werden. mRNA: 3. Möglichkeit Polyadenylierung • Damit die Produktion von Proteinen je nach Bedarf gesteuert werden kann, ist es nicht sinnvoll, dass einmal transkribierte mRNA für immer in der Zelle bleibt und ständig das betreffende Protein hergestellt wird • Die mRNA wird daher in der Zelle durch Enzyme abgebaut • Um den Abbau zu verlangsamen und die Geschwindigkeit des Abbaus steuern zu können, wird an die mRNA ein „Adenosinschwanz", auch Poly(A)-Schwanz gehängt • Die Enzyme (Exonukleasen), die die mRNA abbauen, knabbern also zuerst den Poly(A)-Schwanz ab und dann die mRNA • Je länger der Poly(A)-Schwanz, desto länger kann die mRNA zur Translation benutzt werden • An das 3¹-Ende der mRNA werden also viele Adenin-Nukleotide drangehängt • Capping • An das 5'-Ende wird zum Schutz vor Abbau eine „Kappe", bestehend aus einem modifizierten Guanin-Nukleotid, gehängt • Außerdem dient die Kappe der Erkennung durch die Ribosomen • findet meist schon während der Transkription statt, die RNA-Polymerase bildet die mRNA ja von 5' nach 3', am 5'-Ende kann also schon gleich etwas angehängt werden Transkriptionsfaktoren • (Regulatorische Proteine) Binden an TATA-Box in Promoterregion weitere Proteine können daran binden RNA-Polymerase kann binden Transkription • Enhancer • Kontrollsequenzen, die Aktivatorproteine binden o durch Schleifenbildung erhöht Transkriptionsrate ▶ • Silencer • Kontrollsequenzen, die Repressorproteine binden durch Schleifenbildung verringern Transkriptionsrate Zusammenfassung Transkriptionsfaktoren Promotor Transkriptionsfaktoren sind regulatorische Proteine, die die Transkriptionsrate sowohl erhöhen als auch hemmen können. Die für den Start der Transkription erforderliche RNA-Polymerase II kann nicht ohne Weiteres an den Promotor binden. Um diesen Bereich für die RNA-Polymerase Il zugänglich zu machen, sind Transkriptionsfaktoren erforderlich. Sie binden an die TATA-Box innerhalb des Promotors. Die Bindung des Transkriptionsfaktors IID bewirkt eine Änderung seiner Struktur und die der DNA, wodurch der Bereich weiteren Transkriptionsfaktoren (A, B, C) zugänglich gemacht wird. TFIID TA ATAT Promotor Die Bindung mehrerer Transkriptionsfaktoren erlaubt es der RNA-Polymerase II, an den Transkriptionskomplex anzudocken und die Transkription zu starten. TFULD RNA- A DB Polymerase II ATAT Enhancer regulatorische DNA-Region Initiationsstelle der Transkription RNA-Polymerase Enhancer Transkrip- tionsfaktor Initiationsstelle der Transkription 3 Transkriptionskontrolle wachsende RNA TATA-Box-bindendes Protein keine Transkription Promotor mit TATA-Box 3 Enhancer-bindender. Transkriptionsfaktor 5'/ Transkription RNA-Polymerase • Proteinbiosynthese beginnt immer mit dem Startcodon AUG • Man landet bei der Aminosäure Methionin = erste Aminosäure von der Zelle gebildeten Proteins Der genetische Code ist... • universell -> für alle Lebewesen gleich • redundant/degeneriert -> Es gibt viel mehr Kombinationsmöglichkeiten im Basentriplett (insgesamt 64, 4*4*4) als Aminosäuren, für die die Codons codieren -> Der genetische Code codiert für 20 proteinogene (proteinbildende) Aminosäuren -> Dadurch gibt es mehrere Basentripletts, die für die gleiche Aminosäure codieren -> Häufig ist die letzte Base egal, nur die beiden ersten Basen entscheiden die Aminosäure • nicht überlappend -> jede Base ist fest einem Codon zugeordnet und jedes Codon steht für sich -> Es ist nicht so, dass die zweite Base eines Codons gleichzeitig die erste Base des nächsten Codons ist • Kommafrei -> Codons binden sich ohne Unterbrechung aneinander an • Eine 21. proteinogene Aminosäure (Selenocystein) kann bei einer bestimmten räumlichen Struktur der mRNA zusätzlich eingebaut werden Regulatorgen: Außerhalb des Lactose- Operons gelegenes Gen, dessen Genprodukt ein Repressor ist. • Regulation der Transkription erfolgt durch spezifische Abschnitte auf dem ringförmigen Bakterienchromosom mRNA Regulation der Proteinbiosynthese bei Transkription Ribosom Translation/ Prokaryoten Repressor Operon: Funktionseinheit aus Promotor, Operator und Strukturgenen gern. MUMMUDA Promotor: Ansatzstelle der RNA-Poly- merase. Die RNA-Poly- merase ist nötig, um die mRNA zu bilden. RNA- Polymerase Operator: Schalter, der den Zugang der RNA- Polymerase zur Transkription zulässt oder nicht. An den Operator kann sich der Repressor reversibel anla- 1 Regulation der Genaktivität bei Bakterien - das Operon-Modell: Hemmung der Genaktivität Strukturgene Gene, die für Enzyme codieren, die am Abbau von Lactose beteiligt sind; hier drei Gene (lac Z, lac Y, lac A). lac Z lac Y lac A Repressor: Protein mit je einer spezifischen Bindungsstelle für den Operator und den Induktor, hier z. B. Lactose. Der aktive Repressor bindet nach dem Schlüssel-Schloss-Prinzip an den Operator und hindert dadurch die RNA-Polymerase an der Transkription. Lactose MMMMMM 3 Regulation der Genaktivität bei Bakterien - das Operon-Modell: Induktion der Genaktivität durch Lactose 11 Bei angelagertem Repressor können die Strukturgene nicht abgelesen werden.. 12 13 L> Substratinduktion Lactose ist das Substrat von Enzymen, deren Synthese es herbeiführt. Regulator- RNA- Gen Polymerase Promotor Operator $1 MENDIM mRNA inaktiver Repressor Enzym 1 Strukturgene S2 S3 S4 S5 Enzym 3 0-0-0-0 Bildung von Tryptophan Endprodukt-Hemmung bei der Tryptophan-Synthese, a) Bildung von Regulator- RNA- Gen Polymerase Promotor Operator Strukturgene S1 S2 S3 S4 S5 AMDAMAN IM 上上上之 b Tryptophan, b) Hemmung aktiver Repressor -> Endprodukt hemmung Endprodukt sorgt für Aktivierung des Repressors Tryptophan Bei Anhäufung von Tryptophan wird die Produktion gehemmt. Mutationen • Mutationen können nur vererbt werden, wenn sie auch in den Keimzellen eines Organismus vorhanden sind Genommutation (numerische Chromosomenaberrationen) • Veränderungen in der Anzahl der Chromosomen • Das Vorhandensein des normalen Chromosomensatzes = Euploidie (Eu = gut, richtig), Abweichung in der Anzahl der Chromosomen als Aneuploidie • Im Karyogramm sichtbar • Nur sehr wenige überlebensfähig • Trisomie 21, 18 und 13 sind i.d.R. die einzigen lebensfähigen Trisomien . z.B. Trisomie 21 • Ursache ist eine Non-Disjunktion (Nichttrennung) in der Meiose Monosomie: • bei einem Chromosomenpaar nur eine Ausführung anstatt zwei • Non-Disjunktion führt dazu, dass eine der bei der Meiose entstehenden Tochterkeimzellen zwei Chromosomen eines Typs bekommt, die andere Tochterzelle keins • Bei Vereinigung mit der Keimzelle des Partners kommt dann ein Chromosom hinzu • In den Zellen, wo vorher schon zwei Chromosomen waren, kommt es zur Trisomie, in denen, wo keine waren, kommt es nach Vereinigung zur Monosomie © X© (9 • Es kommt also genauso häufig zu Monosomien wie zu Trisomien, autosomale onosomien sind aber nicht lebensfähig Gonosomen: • Es gibt zwei relevante numerische Chromosomenaberrationen der Gonosomen • Zum einen das Turner-Syndrom, XO, bei dem als Geschlechtschromosom nur ein X-Chromosom auftritt . Es wird auch als Monosomie X bezeichnet • Betroffene Menschen sind dementsprechend weiblich • Es kommt zu verschiedenen Fehlbildungen, die Intelligenz ist aber durchschnittlich und die Lebenserwartung normal • Betroffene sind meist unfruchtbar • Klinefelter-Syndrom kommt es bei den Geschlechtschromosomen zu XXY • Die Betroffenen sind männlich, haben aufgrund der zwei X-Chromosomen aber weibliche Züge, wie weibliche Fettverteilung, Brustbildung und Unterentwicklung der Hoden . Auch sie sind i.d.R. unfruchtbar Erblichkeit: • Kommen die Genommutationen auch in den Keimzellen eines Menschen vor, sind sie erblich, wenn eine Fruchtbarkeit besteht BBC • Bei einem Menschen mit Trisomie 21 würden in der Keimzellbildung in der Meiose I die homologen Chromosomen normal getrennt werden • Für das 21. Chromosom bedeutet das also, dass zwei Chromosomen in eine Tochterzelle wandern, und ein Chromosom in die andere • In der Meiose II trennen sich dann die Chromatiden • 50% der Keimzellen haben also eine normale Chromosomenverteilung, die anderen 50% zwei Chromosomen 21, wodurch es bei Vereinigung mit einer normalen Keimzelle des Partners zu einer Trisomie kommen würde Chromosomenmutationen • Form und Struktur der Chromosomen verändert • Meist im Karyogramm erkennbar Deletion PETERS FOR Insertion #SHCHICH Duplikation Inversion Translokation DOTE 4 =16-7) • Deletion ist das Fehlen von Abschnitten • Duplikation die Verdopplung von Abschnitten • Inversion die Drehung von Abschnitten • Insertion das Einfügen von Abschnitten in ein anderes Chromosom • Translokation das Verlagern von Teilstücken • Die Auswirkungen sind sehr unterschiedlich und können schwer sein, wenn die Änderung wichtige Gene betrifft • Dann sind die Zellen nicht lebensfähig • Bei der Translokation kann man in balancierte und unbalancierte Translokation unterscheiden • Bei der balancierten Translokation ist die Gesamtmenge des genetischen Materials nicht verändert, hier wurde also nur ein Stück verlagert • Meist hat diese Mutation keine Auswirkungen, solange die Trennung nicht genau in einem wichtigen Gen stattgefunden hat • So kann beispielsweise der Großteil des Chromosoms 21 sich an das Chromosom 14 heften. Die Menge des genetischen Materials ist unverändert • Bei den Nachkommen kann es dann aber zur unbalancierten Translokation kommen • Wenn ein Vater mit einer balancierten Translokation ein Chromosom des 21. Chromosomenpaares am 14. Chromosom trägt und in einer der Keimzellen dieses kombinierte 14;21 Chromosom und sein normales 21. Chromosom weitergibt, gibt es bei Vereinigung mit der Eizelle insgesamt drei Varianten des Chromosom 21 • Eins von der Frau, ein normales von ihm und ein drittes am Chromosom 14 m CO 19 ww!!! .. 12 13 14 IDO HIDO 21 219 TIDO UU 22 ITEMIDO 15 16 1° > mcm T 18 • Man spricht dann hier von einer Translokations-Trisomie Genmutation • Veränderungen innerhalb eines Gens • geschieht durch Veränderungen der Basenabfolge • Bei Veränderung einer Base →> Punktmutation und unterscheidet in Substitution, Deletion und Insertion • Ursachen sind fehlerhafte Replikation oder Schädigung der DNA durch äußere Einflüsse, wie z.B. UV-Licht oder radioaktive Strahlung, die deswegen auch als Mutagene bezeichnet werden Substitution • Austausch einer Base in der DNA • Nach Auswirkung für die Proteinbiosynthese unterscheidet man in Stille Mutation, Missense Mutation, Nonsense Mutation • Die Mutation der DNA wird bei der Transkription in mRNA abgeschrieben • Aufgrund der Redundanz des genetischen Codes kann eine Mutation folgenlos bleiben, v.a. wenn die dritte Base eines Codons der mRNA betroffen ist . Wurde bei einer Punktmutation z.B. aus dem Codon GUU nach Mutation GUA, wird immer noch die Aminosäure Valin gebildet, die Mutation hat daher keine Auswirkung, es ist eine stille Mutation . Wenn durch die Substitution eine andere Aminosäure codiert wird, bezeichnet man die Mutation als Missense-Mutation • Das Protein kann in seiner Funktion verändert sein • Bei einer Nonsense-Mutation wird statt für eine Aminosäure für ein Stopcodon codiert, die Proteinbiosynthese daher abgebrochen • Je nachdem, ob die Mutation am Anfang oder Ende einer mRNA auftritt, kann das entstehende Protein funktionsgestört oder funktionslos sein • Werden Basen des gleichen Typs (Purin- gegen Purin- oder Pyrimidin- gegen Pyrimidinbase) gegeneinander ausgetauscht, spricht man von Transition • Werden Basen unterschiedlichen Typs gegeneinander ausgetauscht, spricht man von Transversion Deletion • eine Base wird gelöscht Transversion Transition Purin A с Transversion Transition Pyrimidin Insertion • zusätzliches Basenpaar wird hinzugefügt Polymerasekettenreaktion (PCR) Gentechnik • dient der Vervielfältigung von DNA-Abschnitten • Bei jedem Zyklus wird die DNA-Menge verdoppelt (exponentiellen Vermehrung) ● Einzelstränge werden aufgetrennt • an jedem Einzelstrang bildet die DNA-Polymerase einen komplementären Strang • Danach liegt also die doppelte Anzahl von DNA-Strängen vor • Wird der Schritt wiederholt, dann verdoppelt sich auch hier wieder die Anzahl der Stränge Denaturierung: • Damit der Doppelstrang sich in zwei Einzelstränge teilt, müssen die Wasserstoffbrückenbindungen aufgetrennt werden • Da es keine kovalente Bindungen sind, reicht hier Hitze, um die Molekularbewegung so zu erhöhen, dass die Wasserstoffbrücken gelöst werden • Für die Denaturierung wird die doppelstränge DNA daher auf ca. 95° C erhitzt Primerhybridisierung (Annealing): • DNA-Polymerase kann nicht frei“ mit der Synthese eines neuen Strangs beginnen, sondern benötigt wie bei der DNA-Replikation einer Zelle immer einen Primer -> Primer muss in der Lösung vorhanden sein, die sich an die DNA anlagern • Hierfür wird die Temperatur abgesenkt • Die Primer bestehen hier aber nicht aus RNA, sondern aus DNA -> verbleiben im neu gebildeten Strang; müssen nicht entfernt werden • Primer müssen genau zu der DNA passen, die vervielfältigt werden soll • Also komplementär zum Anfang eines Strangs sein, ab dem dann die DNA- Polymerase vervollständigen kann • Man benötigt daher zwei verschiedene Primer für beide Einzelstränge, weil ein Primer immer nur komplementär zu einem Strang sein kann • Meist möchte man nicht den kompletten DNA-Strang vervielfältigen, sondern nur einen Abschnitt, die Primer müssen dann jeweils komplementär zum Beginn dieses Abschnitts sein Elongation • Vervollständigung des Strangs • DNA-Polymerase beginnt am Primer und bildet bis zum Ende der DNA einen komplementären Strang • neue Strang wird von 5' zum 3`-Ende gebildet • Dafür benötigt die DNA-Polymerase die Nukleotide, die in der Lösung in Form von Nukleotidtriphosphaten schwimmen müssen • Also Desoxyadenosintriphosphat (dATP), dCTP, dGTP und dTTP • Die Energie, die beim Abspalten von zwei Phosphaten frei wird, wird für die Polymerisation genutzt • Außerdem benötigt die Polymerase Mg2+ zum Arbeiten • Damit die Polymerase nicht schon bei der Denaturierung zerstört wird, verwendet man in der Regel hitzestabile DNA-Polymerase (Taq-Polymerase) • Temperaturen von ca. 70°C • Danach wiederholen sich die Schritte, die Temperatur wird also wieder erhöht, um die DNA zu denaturieren, dann wieder abgekühlt für die Primer- Anlagerung, dann findet wieder die Elongation statt A G wwwwwwwww ‒‒‒‒‒‒‒‒‒‒‒‒‒‒‒ B www.m H THE ¨¨¨¨¨¨¨¨¨¨¨¨¨ TANA с wwwwwww...wur 1 www. T T D || E T J TAY Primer www.template DNS www. synthetisierte DNS Polymerase Nukleotide Für die PCR werden also folgende Dinge benötigt: • Eine zu vervielfältigende DNA • Zwei passende Primer Von den beiden dann jeweils sehr viele, da sie Teil der neuen DNA-Stränge werden, bei der PCR also ,,verbraucht werden • Die DNA-Polymerase mit Mg2+ • Die 4 Nukleotide in Form von dATP, dGTP, dCTP und dTTP • Der ,,Thermocycler" in dem die Reaktion stattfindet, der die Temperatur entsprechend der Schritte zyklisch herauf und herunterregelt Klonierung • Die PCR erlaubt die Vervielfältigung von DNA im Labor, Klonierung erlaubt die Vervielfältigung in vivo • Dies macht man sich z.B. zunutze, um Gene in Bakterien einzufügen, mit dem Ziel, dass diese Bakterien dann das Protein produzieren • Dabei wird die gewünschte DNA in das ringförmige Plasmid von Bakterien eingeschleust Hierfür benötigt man... das Gen, das man einschleusen will • das Plasmid • ein Enzym, das das Plasmid öffnet (Restriktionsendonuklease), damit die DNA eingefügt werden kann • die Ligase, um die Stücke wieder zu verbinden • Nukleasen sind Enzyme, die DNA abbauen, indem sie die Bindungen zwischen den Nukleotiden spalten • Man unterscheidet in Exonukleasen, die Nukleotide immer nur von den Enden abspalten und Endonukleasen, die innerhalb der DNA die Bindungen trennen 3¹ Exonuklease • Restriktionsendonukleasen sind Endonukleasen, die die DNA nur an bestimmten Stellen spalten, also nur bei einer bestimmten Basensequenz Insert Vektor Restriktion Endonuklease e Ligation Vektor mit Insert • Mit ,,Vektor" ist hier Plasmid gemeint, mit „Insert" die DNA, die eingefügt wird • Die Restriktionsendonukleasen schneiden so, dass „Überhänge“ an der DNA entstehen • Wenn die einzufügende DNA und das Plasmid genau mit der gleichen Restriktionsendonuklease geschnitten wurden, sind die überhängenden Enden (sticky ends) von Insert und Plasmid komplementär zueinander, da sie an Stellen mit gleicher Basensequenz geschnitten werden • So lässt sich das Insert gut ins Plasmid einfügen • Die Ligase bildet dann die Esterbindungen, damit Insert und Plasmid sich kovalent binden und zu einem ringförmigen DNA-Molekül werden • Das Einfügen funktioniert nicht immer, da sich die DNA zufällig genau in die Lücke des Plasmids einfügen muss • Die Ligase kann auch nur das Plasmid ohne eingefügtes Insert wieder schließen, oder auch nur das Insert zu einem Ring verbinden Nach Aufschneiden mit Restriktionsendonuklease: Gewünschtes Ergebnis: Plasmid O O Insert Mögliche unerwünschte Ergebnisse: C • Daher wird meist versucht, die Bakterien mit dem gewünschten Plasmid zu selektieren, z.B. indem in der einzufügenden DNA zusätzlich ein Gen für Antibiotikaresistenz eingefügt wird • Bei Behandlung mit diesem Antibiotikum überleben nur die Bakterien, die ein Plasmid mit dem gewünschten DNA-Abschnitt haben • Alternativ kann das Insert auch für ein Protein kodieren, welches zu einer Farbreaktion führt, wodurch optisch sichtbar wird, welche Bakterienkolonien das Insert in ihren Plasmiden tragen • Die Bakterien vervielfältigen sich dann, vervielfältigen auch das Plasmid und produzieren die Proteine, für die die Gene auf dem Plasmid kodieren • Das Klonieren hat dadurch sehr vielfältigen Nutzen, menschliches Insulin (ein Polypeptid) kann so durch Bakterien hergestellt werden • Da der genetische Code universell ist, also in allen Lebewesen gleich, wird durch die eingefügte menschliche DNA vom Bakterium auch das gleiche Polypeptid hergestellt • Dies bezeichnet man auch als rekombinante Proteinexpression • Rekombinant steht dafür, dass die DNA mithilfe von Gentechnik neu zusammengesetzt (kombiniert) wurde. cDNA • Die DNA darf keine Introns enthalten, da Bakterien nicht Spleißen • Wenn in der menschlichen DNA Introns enthalten sind, und erst nach Spleißen die korrekte mRNA gebildet wird, aus der das korrekte Polypeptid hergestellt wird, würde beim Bakterium aus der eingefügten menschlichen DNA ein anders Polypeptid herauskommen, da das Bakterium bei der Transkription die Introns aus der mRNA nicht herausschneidet • Dieses Problem kann man umgehen, indem man statt der menschlichen bzw. eukaryontischen DNA die fertige mRNA nach Spleißen nimmt, und sie mithilfe des Enzyms Reverse Transkriptase wieder in DNA umschreibt, welche dann komplementär zur fertigen mRNA ist und damit keine Introns mehr enthält • Diese DNA kann dann ins Bakterienplasmid eingefügt werden • Die durch das Enzym gebildete DNA wird dann als cDNA bezeichnet, was für komplementäre (complimentary) DNA steht • Wird die cDNA ins Bakterienplasmid eingefügt, kann nun wirklich das gewünschte Protein entstehen, auch ohne Spleißen. • Dieses Prinzip wird auch genutzt, um RNA in einer Probe mithilfe von PCR nachzuweisen • Einer RNA-Probe wird ein Primer hinzugefügt, der komplementär zum gesuchten RNA-Abschnitt ist, da auch die hier genutzte Reverse Transkriptase einen Primer benötigt • Es handelt sich um eine spezielle Polymerase, welche auch als RNA-abhängige DNA-Polymerase bezeichnet wird • Sie synthetisiert dann einen komplementären cDNA Strang, welcher in den weiteren Schritten mithilfe der normalen DNA-Polymerase vervielfältigt wird • War die gesuchte RNA in der Probe vorhanden, wird man dies anhand des Vorkommens und Anstiegs der cDNA nach wenigen Zyklen messen können • So kann die Reverse-Transkriptase-PCR z.B. zum Nachweis von RNA-Viren verwendet werden, wie dem Coronavirus, aber auch anderen • Wenn eine eukaryontische mRNA in cDNA übersetzt werden soll, kann der erste Primer, der als Ansatzpunkt für die Reverse-Transkriptase fungiert, entweder ganz spezifische Basen für einen gesuchten RNA-Abschnitt tragen oder unspezifisch für die gesamte mRNA sein • Der unspezifische Primer besteht dann aus mehreren Thymin-Nukleotiden, womit er sich einfach an den Poly-A-Schwanz der mRNA binden kann • Da der Poly-A-Schwanz am 3`-Ende liegt, passt es auch, da die cDNA antiparallel verläuft, dort also das 5'-Ende der cDNA liegt • Die cDNA kann daher von der Polymerase ganz normal von 5' zu 3' gebildet werden Gelelektrophorese • Wanderung geladener Teilchen durch ein Gel in einem elektrischen Feld • DNA ist aufgrund ihrer Phosphat-Gruppen eher negativ geladen • Gel herstellen (z.B. aus Agarose) Gel bildet winziges, engmaschiges Netz, das die aufzutrennenden Moleküle bei ihrer Wanderung durch das Gels unterschiedlich behindert (molekulares Sieb) • DNA wird auf das Gel aufgetragen (eine Probe davon kennt man!) • Elektrische Spannung wird angelegt • Moleküle beginnen nun nach ihren Eigenschaften unterschiedlich schnell durch das Gel zu wandern ▶ Kleine, negative Anionen wandern schneller zur positiv geladenen Anode als große Anionen Gleiche Teilchen laufen mit gleicher Geschwindigkeit durch das Gel • Elektrophorese wird beendet, wenn die am schnellsten beweglichen Teilchen das Ende erreicht haben • Mit UV-fluoreszierende Farbstoffen versetze DNA wird von UV-Licht angestrahlt ► DNA-Banden werden sichtbar • Banden werden mit bekannten Probe verglichen Kathode Pufferlösung- Gel zwischen den Glasplatten- Anode + Pufferlösung Aufbringen der Proben z. B. verschiedene Proteine Laufrichtung der negativ geladenen Proteine Kettenabruchmethode/Sanger-Sequenzierung: Denaturierung: • Erhitzen des DNA-Doppelstrangs auf 100 Grad Hybridisierung: Abkühlung des Reaktionsgemisches auf 50 Grad • Binden von radioaktiv markierten Primern an ● Schmelzen des Doppelstrangs, sodass sich die H-Brücken lösen und DNA als Einzelstränge vorliegt die komplementären Sequenzen am 3¹-Ende der DNA • Verteilung der radioaktiv markierten DNA- Einzelstränge mit den vier Nucleotidtriphosphaten und DNA-Polymerase auf vier Reagenzgläser + ein je unterschiedlich modifiziertes Nucleotid • ein Nucleotid ist je für den Abbruch einer Base zuständig, da modifizierte Nucleotide am 3'-Ende keine OH-Gruppe besitzen kein weiteres Nucleotid kann anbinden) Polymerisation: • Synthese eines Komplementärstrangs durch Taq-Polymerase bei ca. 72 Grad • Anlagerung eines ddNTP ▶ Abbruch der DNA-Replikation Entstehung unterschiedlich langer Stränge Dann Gelektrophorese und vom kürzesten Molekül an Sequenz ablesen (komplementärer Strang) 1 Reaktions- ansatz Aufteilung in 4 Reaktions- ansätze 3 DNA- Synthese Gelelektro- phorese + Autoradio- graphie 3¹ CATETTGCAGCCAGT 5 CTACAACGTCGGICA num ✪= A +ddATP dATP +dCTP+dGTP+dTTP Nukleotide (dNTPs) 3₁ 117 DNA-Probe G +ddCTP +ddGTP +ddTTP Primer abgelesene Sequenz: 5 AAGCGTCGGTCA 3' komplementäre Sequenz der DNA-Probe: 3 TTCGAGCCAGT 5' T längstes Fragment kürzestes Fragment 3 LA Laser Reaktionsansatz mit Fluoreszenzfarbstoff markierten ddNTPs Detektor Ⓒ TCTCAGACCAGCTAGGCGTCATA www.hmanand 4 DNA-Sequenzierung mithilfe von Sequenzierautomaten NA Moderne Sequenzierungsautomaten arbeiten nicht mit radio- aktiven Markierungen, sondern mit Fluoreszenzfarbstoffen. Jedes der vier Kettenabbruchnucleotide (ddNTP) wird mit ei- nem anderen fluoreszierenden Farbstoffmolekül gekoppelt und die Sequenzierungsreaktion in einem Reaktionsgefäß durchgeführt. Die entstandenen DNA-Fragmente werden in einer Gel-Kapil- lare elektrophoretisch aufgetrennt. Dabei passieren die ein- zelnen Banden einen Laserstrahl, der die Farbstoffe anregt. Ein Detektor registriert das abgestrahlte Licht und wandelt die Information in digitale Daten um. Das Bandenmuster des Gels wird in ein Kurvendiagramm überragen, aus dem die Sequenz der DNA abgelesen werden kann. DNA-Chip-Technologie • gibt Auskunft darüber, welche Gene in der Zelle aktiv sind • Man entnimmt den Zellen mRNA aus den zu vergleichenden Geweben (mRNA- Moleküle repräsentieren aktive Gene!) • durch Reverse Transkriptase wird mRNA cDNA (doppelsträngig) umgeschrieben • cDNA (doppelsträngig) wird getrennt (cDNA einzelsträngig) • cDNAS verschiedener Proben werden mit verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen markiert • Proben werden gemischt und auf Platten verteilt • In jedem Array ist eine Sorte" DNA-Sonde • Bei Hybridisierungsreaktion ,,fischt" eine DNA-Sonde eine cDNA der Probe mit Komplementärer Basensequenz heraus und bildet Doppelstrang • Nicht hybridisierte Stränge werden herausgewaschen • Aufgrund seiner Fluoreszenzmarkierung werden Doppelstränge mit Laserlicht-Scanner erkannt und am Computerbildschirm als farbiger Kreis wiedergegeben • Färbung eines Kreises hängt davon ab, wie viele DNA-Doppelstränge sich in dem Array gebildet haben und in welchem Verhältnis dabei rot und grün markierte cDNA beteiligt sind Roboterspitze zum Ankleben d nder DNA-Sonden 4 5 6 7 Glasplatte DNA-Chips bzw. Microarray 1 A7 Gl T SIG c 87 einsträngige DNA-Sonde WY C STIFG SAPTC CA =cs PARSPC A 3 D7 A mRNA, Blütenblatt. Reverse Transkriptase cDNA, rot markiert mRNA, Laubblatt Reverse Transkriptase CDNA, grün markiert CDNA, Probe Blütenblatt CDNA, Probe Laubblatt A C O ●●●●● B COO ●● D E F C Bedeutung der Farben im Microana mRNA ist nur in Zellen des Blütenblatts vorhanden mRNA ist in Zellen des Blüten- blatts und in Zellen des Laubblatts in gleichen Mengen vorhanden. mRNA ist nur in Zellen des Laubblatts vorhanden keine Reaktion ● RNA-abhängige RNA-Polymerase-Enzyme (RdRP) ○ ergänzen mRNA-Stränge komplementäre (dsRNA) • dsRNA wird durch Dicer-Enzym in kleine doppelsträngige Bruchstücke (siRNA) zerlegt OsiRNA fungiert als Primer für weitere RdRP-Enzyme, indem sie komplementär an weitere mRNA-Stränge binden (positive Rückkopplung) Stilllegung des Gens Transkription RNA-Interferenz Zellkern mRNA RdRP 2 Modell für den Mechanismus der RNA-Interferenz bei Pflanzen dsRNA www Translation dienen als Primer für Dicer-Enzym siRNA FITT TITTI ZH