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Verfahren der Gentechnik
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Svenja
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11/12/13
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Erläuterung des Verfahrens der Gentechnik einschließlich der Grundoperatoren und Werkzeuge.
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Molekulargenetische Werkzeuge - Bedeutung für genetische Grundoperationen Gentechnik ist die gezielte Neukombination von DNA, allerdings setzt die Arbeit der Biologen bestimmte Bedingungen voraus: Kenntnisse über die Ausgangs DNA ● (Sequenzanalyse) Schneidewerkzeuge für die DNA (Restriktionsenzyme) ● Transport der Fremdgene in die Zellen (Vektoren) Außerdem sind folgende Grundoperationen für jedes gentechnische Experiment erforderlich: Isolation der DNA (z.B. ein Stück der menschlichen DNA und ein bakterielles Plasmid) Gentechnik Bakterien chromosom isoliertes Plasmid Gentransfer Plasmid ohne Fremdgen Babterum mit Plasmid Ohne Fremdgen werden während des 2weiten Schni Hes ausgeschlossen - Plasmid Bakterium rekombinantes Plasmid Bablenum mit Plasmid & Fremdgen werden durch vergleichen der beider Agarböder nerausgefunder Anwendungen menschliche Zelle DNA isoliertes Teilstück menschlicher DNA Babtenum chne Plasmid stirbt im esten Seletetionsschritt ab Rekombination (Einbau der menschlichen DNA in des Plasmid) Gentransfer (das Plasmid wird zusammen mit der menschlichen DNA in ein Bakterium übertragen) Selektion (Überprüfung, ob das Bakterium das Plasmid aufgenommen hat) Zellvermehrung/Klonierung Isolation Rekombination Gentransfer Selektion Isolation Plasmide mit gewünschten Eigenschaften werden aus Bakterienzellen isoliert bzw. Plasmide mit gewünschten Markergenen werden von einem Labor hergestellt. Außerdem wird das Fremd-Gen von dem Genom des Lebewesens mittels eines bestimmten Restriktionsenzyms ausgeschnitten und somit isoliert. Rekombination Das Plasmid, das Fremd-Gen, ein spezifisches Restriktionsenyzm, welches zuvor bereits zum Schneiden des Fremdgens verwendet wurde, werden in einen Reaktionsansatz gegeben. Das Restriktionsenzym schneidet das Plasmid innerhalb eines Markergens. Da das Fremd-Gen als auch die Schnittstelle des Plasmids über sticky ends mit komplementären Basensequenzen verfügen, kann sich das Fremd-Gen in das Plasmid einfügen. Durch das Hinzufügen von Ligase werden die Schnittstellen geschlossen. Da der Einbau zufällig ist, liegen sowohl rekombinante Plasmide mit Fremdgen als auch solche ohne Fremd-Gen vor. Bakterienzellen...
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werden dazu angeregt die Plasmide aufzunehmen. Diese Transformation kann mittels verschiedener Methoden wie der Calciumchlorid-Methode sowie Elektroporation erfolgen. Selektion Da der Gentransfer nicht bei allen Bakterien erfolgreich verläuft, müssen nun die rekombinanten Bakterien identifiziert werden. Dies kann z.B. über die Stempeltechnik/Replika-Plattierung erfolgen, bei der Bakterien erst auf einer Agarplatte mit einem Antibiotikum kultiviert werden, welches nur diejenigen überleben, die ein Plasmid mit Resistenzgen (Markergen) aufgenommen haben. Bakterien ohne Plasmid sterben ab. Mittels einen Stempels wird das charakteristische Koloniemuster auf eine zweite Agarplatte mit einem zweiten Antibiotikum übertragen. Bakterien mit rekombinanten Plasmid sterben ab, da das Markergen, welches für diese Resistenz kodierte durch ein erfolgreiches Einfügen von Fremd-Gens, zerschnitten und damit funktionstüchtig gemacht wurde. Bakterien mit einem Plasmid ohne Fremd-Gen überleben. Über den Vergleich der Koloniemuster lassen sich die Kolonien identifizieren, die das Fremd-Gen exprimieren können. Klonierung Die Bakterienzellen werden kultiviert, wodurch sich diese vermehren/teilen, sodass viele Klone einer Zelle vorliegen, d.h. Die Wahrscheinlichkeit ist sehr hoch, dass alle das Fremd-Gen in sich tragen. Die Bakterienklone stellen nun das gewünschte Produkt über die Proteinbiosynthese her. Dieses wird beispielsweise gewonnen, indem die Bakterien abgetötet werden und das gewünschte Produkt von den anderen Zellbestandteilen gereinigt/isoliert wird.
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Erläuterung des Verfahrens der Gentechnik einschließlich der Grundoperatoren und Werkzeuge.
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