Alternativer Bildtext:

liegt als ringförmige DNA frei im Zellplasma Membran- einstülpung sich unterscheiden Zellplasma Plasmid Bakterien- chromosom Ribosom Geißel 1 Gentransfer O ● ● O ● gewünschte Gen wird mit Hilfe einer spezifischen Gensonde identifiziert von einem Restriktionsenzym herausgeschnitten -> sticky ends entstehen ,,Ziel-Plasmid" wird mit dem gleichen Restriktionsenzym geschnitten (gleiche sticky ends entstehen) isoliertes Gen wird in die Zielzelle übertragen Ligase verknüpft die DANN-Stränge -> rekombinante DNA entsteht DNA muss vom Bakterium aufgenommen werden Prüfung, ob das Fremd-Gen erfolgreich eingebaut wurde Bakterium / transgene Zelle produziert das gewünschte Protein hier: Bakterium mit Doppelresistenz entsteht ● A Legende Plasmid A 4 B Resistenzgen B Gensonde Plasmid B Resistenzgen A Genkleber (Klebeenzym) LIGASE Stempeltechnik: Prüfung, indem das Bakterium auf unterschiedliche Nährböden (versetzt mit Antibiotika) gegeben wird O O Genschere (Schneideenzym) RESTRIKTIONSENZYM Plasmide sind durch Pfeile mit dem Untergrund verbunden, auf dem sie die entsprechenden Bakterien überleben könnten Problem: ● bakterielle Krankheitserreger werden durch Antibiotika bekämpft resistente Bakterien überleben, d.h. man bleibt krank -> zweites Antibiotika nötig je mehr unterschiedliche Antibiotika verabreicht werden, desto mehr verschiedene resistente Bakterien werden regelrecht „herausselektiert" • ,,multiresistente Keime" sind nicht mehr mit Antibiotika behandelbar 2 Doppelresistente Bakterien Erzeugung von Bakterien mit Doppelresistenz ist nicht der tiefere Sinn der Gentechnik → hochgefährliche Krankheitserreger, die mit Antibiotika kaum zu bekämpfen wären nicht die Resistenz-Gene sind die eigentliche, genetisch wertvolle Fracht des veränderten Bakteriums (Mittel zum Zweck) → eigentlich entscheidendes Instrument zur wirksamen Selektion anderer, wertvoller Versuchsergebnisse ● Doppelresistenz-Plasmide werden mit einem ,,wertvollen Gen" zusammengebracht, das z.B. die Produktion eines gewünschten Proteins bewirkt wird; nur einige wenige Plasmide bauen das neue Gen in gewünschter Form ein (unter Inaktivierung eines der beiden Resistenzgene) der finale Schritt selektiert dann aus der großen Menge untauglicher Bakterien nur den Stamm, der das neue Gen funktionstüchtig eingebaut hat; dieser Stamm wird über Klonierung massenweise vermehrt und zu industriellen Produktionen des gewünschten Proteins eingesetzt Gentechnisch hergestelltes Insulin Ampicillin- Resistenz-Gen Plasmid unverändertes Plasmid E. coli ohne B-Galactosidase-Gen B-Galactosidase- keine Resistenz gegen Ampicillin, keine Kolonien Gen 0.0 Insulin-Gen Transformation und Ausbringen auf Selektions- medium (X-Gal*, Amp') rekombi- nantes Plasmid Resistenz gegen Ampicillin, blaue Kolonien Ampicillin-Resistenz, + Insulin-Gen, weiße Kolonien 3 Selektion und Herstellung eines rekombinanten Bakteriums - Insulin: Hormon, das in Zellen der Bauchspeicheldrüse gebildet wird - bewirkt, dass Körperzellen Glucose aus dem Blut aufnehmen -> Blutzuckerspiegelsenkung - 1982: menschliches Insulin erstmals mithilfe transgener Bakterien hergestellt: → beide AS-Ketten des Insulins werden getrennt produziert und dann verbunden → Einfügen eines Insulin-Gens in Plasmide nicht immer erfolgreich → Verwendung von 2 Markergenen, um Bakterien mit rekombinantem Plasmid zu erkennen: Bakterien mit Resistenz-Gen sind resistent gegen das Antibiotika Ampicillin und können auf ampicillinhaltigen Nährböden wachsen → Bakterien mit ß-Galactosidase-Gen können Lactose abbauen → Enzymproduktion wird durch Promotor gesteuert, der durch Lactose aktiviert wird → Vektor für die Insulin-Gene enthält beide Markergene → bei erfolgreichem Einbau im Bereich des ß-Galactosidase-Gens wird dies unterbrochen → bei der Selektion der Bakterien wir statt Lactose X-Gal verwendet → Abbau führt zu einer Blaufärbung ● Insulin-Gen wird in Plasmid eingebaut, das ein Resistenz-Gen Ampicillin und ein ß- Galactosidase-Gen enthält ● Einbaustelle für das Insulin-Gen im Vektor wird so gewählt, dass sich das Insulin-Gen in die Gensequenz des ß-Galactosidase-Gen einbaut und diese zerstört ● rekombinante Plasmid wird in Bakterium eingeschleust; Bakterien werden auf einem Medium kultiviert, das Ampicillin und X-Gal enthält ● X-Gal kann von Bakterien abgebaut werden, die das B-Galactosidase-Gen besitzen Abbau führt zu einer Blaufärbung der Bakterienkolonien → Bakterien, bei denen es gelungen ist, ein rekombinantes Plasmid einzuschleusen, können selektiert werden diese können kein X-Gal abbauen und erscheinen weiß 3 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ● ● ● Denaturierung 95 °℃ Anheftung Hybridisieren DEX Echtzeit-PCR DEX DEX 55 °℃ durch die hohe Temperatur werden die Wasserstoffbrücken gelöst, die DNA denaturiert bei Temperatursenkung können sich die Primer an ihre komplementären Basen anlagern bei mittlerer Temperatur lagert sich die (hitzebeständige) DNA-Polymerase (Taq- Polymerase) an und bindet jeweils die komplementären Nukleotide an den sich verlängernden Strang; wiederholt sich mehrmals Unterdrückerfarbstoff hindert Fluoreszenzfarbstoff am Leuchten, solange sich beide Farbstoffe in direkter Nähe befinden Klonierung von DNA über Plasmide und Bakterienkulturen würde mehrere Tage dauern → bei der PCR verdoppelt sich die Anzahl der DNA-Stränge in weniger als 10 min unverzichtbar für die Erkennung von Virusinfektionen, Erbkrankheiten, das Erstellen genetischer Fingerabdrücke und das Klonen von Genen Bezeichnung,,Taq"-Polymerase: abgeleitet von dem in heißen Quellen lebenden Bakterium Thermus aquaticus, dessen DNA-Polymerase für die PCR genetisch modifiziert wurde; hat bei 70-75 °C ihr Temperaturoptimum Farbstoff Transkriptom: Menge an mRNA-Moleküle, die eine Zelle gerade produziert ● Echtzeit-PCR um herauszufinden, wie viel von einer bestimmten m-RNA produziert wird gesamte m-RNA einer Zelle wird isoliert ● mit Enzym Reverse Transkriptase lässt sich aus m-RNA komplementäre DNA erzeugen → c-DNA (complementary DNA) mit der c-DNA wird Echtzeit-PCR durchgeführt: zusätzlich zu den bei einer PCR üblicherweise eingesetzten Primern, den Nucleotiden und der Taq-Polymerase wird Taqman-Sonde hinzugefügt → kurzes DNA-Stück, komplementär zum Teil der Ziel-DNA, das unmittelbar hinter der Bindungsstelle für den Primer liegt; am Ende je Unterdrücker- und Fluoreszenzfarbstoff Taq-Polymerase Verlängerung Polymerisieren + E-K + 72 °C Unterdrücker Taqman-Sonde Nucleotide + TIT Primer 2 Ablauf der Echtzeit-PCR Ablauf der Echtzeit-PCR analog zur herkömmlichen PCR: - Primer und Taqman-Sonde setzen sich an passende Stelle der Ziel-DNA - mithilfe der Taq-Polymerase wird DNA-Einzelstrang zum Doppelstrang ergänzt - gelangt Taq-Polymerase an Taqman-Sonde, wird Taqman-Sonde gespalten, sodass Fluoreszenzfarbstoff frei wird und leuchtet - währenddessen wird Synthese des komplementären DNA-Strangs fortgesetzt - je mehr DNA-Stränge vervielfältigt werden, desto mehr Fluoreszenzfarbstoff leuchtet - Intensität des Leuchtens direkt proportional zur Menge der vervielfältigten DNA - Rückschlüsse können auf ursprünglich vorhandene Menge bestimmter m-RNA- Moleküle in der Zelle gezogen werden und Ablauf der PCR verfolgen ● Untersuchung bestimmter Krankheiten: ● - Nachweis möglich, ob ein Genabschnitt, der evtl. ein mutiertes Gen enthält, gerade abgelesen wird - Nachweis möglich, ob ein nicht-mutiertes Gen abgelesen oder nicht abgelesen wird Restriction fragment length polymorphism (RFLP) 19. Jhd: Mord und sexueller Missbrauch von 2 15-jährigen Mädchen Peter Gill findet Methode, um Vaginal- und Spermienzellen voneinander zu trennen → Spermienzellen des Mörders können isoliert werden Alec Jeffreys gelang es, aus der DNA menschlicher Zellen ein genetisches Profil zu erstellen, das einem einzelnen Menschen wie der Fingerabdruck eindeutig zugeordnet werden kann →➜ genetischer Fingerabdruck die genetische Information ist in allen Zellen eines menschlichen Körpers identisch, auch wenn sie unterschiedliche Funktionen ausüben → jeder Mensch hat durch seine individuelle Anordnung der 3 Milliarden Nukleotide der DNA eine einzigartige genetische Identität (Ausnahme: eineiige Zwillinge) Introns: Bereiche nicht kodierender DNA → da können sich ohne Nachteil für das Individuum über Generationen Mutationen anhäufen → größere Unterschiede in der Nukleotidabfolge in Introns als in Exons → enthalten häufig sich 2- bis 100-mal wiederholende Sequenzen von 10-100 Basenpaaren Länge, die wegen ihrer variablen Häufigkeit bei jedem Menschen ein individuelles Muster ausprägen RFLP: die DNA verschiedener Menschen wird aufgrund von differierender Lage gleicher Erkennungssequenzen von Restriktionsenzymen in Teilstücke zerschnitten, die sich sowohl in der Zahl als auch in der Länge unterscheiden Gelelektrophorese Minus-Pol Z Wanne E Plus-Pol (Agarose-)Gel Geltasche DNA-Fragment 20 15 10 Vater Mutter Kind 1 Kind 2 Kind 3 Kind 1: Ist das leibliche Kind von Mutter und Vater, da es mit beiden übereinstimmende DNA-Fragmente aufweist. Kind 2: Ist ein Kind des Vaters aus einer anderen Beziehung, da es Übereinstimmungen mit dem Vater, aber nicht mit der Mutter aufweist. Kind 3: Ist z. B. adoptiert; es zeigt weder mit der Mutter noch mit dem Vater genetische Übereinstimmungen. 5