DNA-Sequenzierung nach Sanger: Ausgangsstoffe und Vorgang
Die Sanger-Sequenzierung ist eine fundamentale Technik in der Molekularbiologie zur Bestimmung der Nukleotidabfolge in DNA-Molekülen. Diese Methode, auch als DNA-Sequenzierung nach Sanger bekannt, nutzt spezifische Ausgangsstoffe und folgt einem präzisen Ablauf.
Zu den essentiellen Ausgangsstoffen gehören:
- DNA-Leitstrang
- Deoxynukleotide dNTPs
- Dideoxynukleotide ddNTPs
- DNA-Polymerase
- Primer
Vocabulary: Dideoxynukleotide ddNTPs sind modifizierte Nukleotide, die den Kettenabbruch bei der DNA-Synthese verursachen.
Der Vorgang der Sanger-Sequenzierung lässt sich in mehrere Schritte unterteilen:
- Die DNA wird erhitzt, um die Doppelstränge zu trennen.
- Die denaturierte DNA wird auf vier Ansätze verteilt.
- Jedem Ansatz werden Nukleotide, Primer, DNA-Polymerase und ein spezifisches Dideoxynukleotid hinzugefügt.
- Primer und Nukleotide lagern sich an die Einzelstränge an.
- Die DNA-Polymerase verbindet die Nukleotide zu komplementären Strängen.
- Deoxynukleotide und Dideoxynukleotide werden hinzugegeben und lagern sich an den DNA-Strang an.
- Der komplementäre DNA-Strang verlängert sich.
- Bei einem Teil der Synthese wird ein Dideoxynukleotid eingebaut, was zum Kettenabbruch führt.
Highlight: Der Einbau von Dideoxynukleotiden führt zu DNA-Fragmenten unterschiedlicher Länge, die alle mit demselben Nukleotid enden.
- Mittels Gel-Elektrophorese werden die Sequenzierungsansätze getrennt.
- Das resultierende Bandenmuster entspricht DNA-Molekülen, die sich um jeweils ein Nukleotid in der Länge unterscheiden.
- Alle DNA-Stränge in einem Ansatz enden mit demselben Nukleotid.
Example: Wenn man die Sequenz 5'-GATCATGC-3' sequenzieren würde, würde man im ddATP-Ansatz Fragmente der Längen 2 und 6 Nukleotide erhalten.
Die Sanger-Sequenzierung ermöglicht so eine präzise Auswertung der DNA-Sequenz und findet breite Anwendung in der DNA-Sequenzierung. Trotz neuerer Methoden wie der Illumina-Sequenzierung oder Next Generation Sequenzierung bleibt die Sanger-Methode aufgrund ihrer Genauigkeit und Zuverlässigkeit ein wichtiges Werkzeug in der molekularbiologischen Forschung und Diagnostik.
Definition: Die Gel-Elektrophorese ist eine Methode zur Auftrennung von DNA-Fragmenten nach ihrer Größe in einem elektrischen Feld.
Die Vorteile der Sanger-Sequenzierung liegen in ihrer hohen Genauigkeit und der Möglichkeit, relativ lange DNA-Abschnitte zu sequenzieren. Zu den Nachteilen zählen der relativ hohe Zeit- und Arbeitsaufwand sowie die Begrenzung auf einzelne Gene oder kleinere Genomabschnitte.
