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DNA-Sequenzierung

11.1.2021

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DNA-SEQUENZIERUNG
- Bestimmung der Basenabfolge eines DNA-Stranges
- hierfür wird die DNA zu Einzelsträngen denaturiert und mit geeigneten P

DNA-SEQUENZIERUNG - Bestimmung der Basenabfolge eines DNA-Stranges - hierfür wird die DNA zu Einzelsträngen denaturiert und mit geeigneten Primern, DNA-Polymerasemolekülen und den vier verschiedenen Desoxyribonukleosid-Triphosphaten (dNTP) versetzt Thriphosphate (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) dienen als Substrate der DNA-Replikation - es werden außerdem wenige Didesoxyribonukleosid-Triphosphate (ddNTP) hinzugefügt die vier ddNTP sind jeweils mit verschiedenen Fluoreszenzmarkern versehen - bei vorangeschrittener Replikation enthält der Ansatz nun neben den Matrizenfragmenten auch unterschiedlich lange DNA-Fragmente, die jeweils mit einem fluoreszierenden ddNTP enden - daraufhin werden durch Erhitzen die neuen Stränge von der Matrize getrennt - sie werden mithilfe von Elektrophorese der Länge nach sortiert - die Farbe der Fluoreszenzmarker wird per Laser bestimmt und somit wird deutlich, welches ddNTP sich am Ende des Fragments befindet - ein Computer kann nun aus dieser Abfolge die Nukleotidsequenz des synthetisierten Stranges errechnen und sie in die Sequenz des Matrizensstranges umwandeln Funktion der ddNTP-Moleküle: -daher, dass den Molekülen am 3-Kohlenstoff atom der Desoxyribosedie Hydroxylgruppe fehlt können sie zwar in die wachsende DNA-Kette eingebaut werden, allerdings kann die Verknüpfung mit einem nächsten Nukleotid nicht stattfinden die Synthese bricht also an dieser Stelle ab und es entstehen unterschiedlich lange DNA-Fragmente - außerdem tragen sie die Fluoreszenzmarkierung, sodass jedes fragment in der den jeweiligen Basen entsprechenden Farbe fluoresziert Base (A, T, G oder C) -0-CH₂ Desoxyribonukleotid- HO H Triphosphat (dNTP) AUTH 5' ?? ??????? ???? ?? ???? 3' ddCTP ddGTP ddTTP ddATP T?????????????????? 3 GCG 5 5 T???????? ???? ??...

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?CGC 3' 3' AATC TGGGCTATTCGGGCG 5' TT ????????? ?????CGC 3' 3 ATC TGGGCTATTCGGGCG 5' Jeder Strang fluoresziert in der Farbe des jeweiligen ddNTP an seinem Ende. Die Farbe wird mit- hilfe eines Laserstrahls bestimmt. Die Sequenz des neu synthetisierten DNA-Strangs lässt sich nun ableiten.. und in die Sequenz des Matrizenstrangs umwandeln. O-P-O- 5-0-P o Didesoxyribonukleotid- H Triphosphat (ddNTP) Durch die fehlende OH-Gruppe an der 3'-Position können keine weiteren Nukleotide angehängt werden. Matrizenstrang Primer (mit bekannter Sequenz) Laser Base (A, T, G oder C) Elektro- phorese 3' TCTACCUTA TUUUin größtes Fragment Fotozelle kleinstes Fragment 3' AATCT GGGC TATTCGG 5' 5 TTAGA CCCGATAAGCC 3'