DNA-Sequenzierung

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11/12/13

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Bestimmung der Basenabfolge eines DNA-Stranges

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DNA-SEQUENZIERUNG - Bestimmung der Basenabfolge eines DNA-Stranges - hierfür wird die DNA zu Einzelsträngen denaturiert und mit geeigneten Primern, DNA-Polymerasemolekülen und den vier verschiedenen Desoxyribonukleosid-Triphosphaten (dNTP) versetzt Thriphosphate (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) dienen als Substrate der DNA-Replikation - es werden außerdem wenige Didesoxyribonukleosid-Triphosphate (ddNTP) hinzugefügt die vier ddNTP sind jeweils mit verschiedenen Fluoreszenzmarkern versehen - bei vorangeschrittener Replikation enthält der Ansatz nun neben den Matrizenfragmenten auch unterschiedlich lange DNA-fragmente, die jeweils mit einem fluoreszierenden ddNTP enden - daraufhin werden durch Erhitzen die neuen Stränge von der Matrize getrennt - sie werden mithilfe von Elektrophorese der Länge nach sortiert - die Farbe der Fluoreszenzmarker wird per Laser bestimmt und somit wird deutlich, welches ddNTP sich am Ende des Fragments befindet - ein Computer kann nun aus dieser Abfolge die Nukleotidsequenz des synthetisierten Stranges errechnen und sie in die Sequenz des Matrizensstranges umwandeln Funktion der ddNTP-Moleküle: -daher, dass den Molekülen am 3-Kohlenstoffatom der Desoxyribosedie Hydroxylgruppe fehlt können sie zwar in die wachsende DNA-Kette eingebaut werden, allerdings kann die Verknüpfung mit einem nächsten Nukleotid nicht stattfinden die Synthese bricht also an dieser Stelle ab und es entstehen unterschiedlich lange DNA-Fragmente - außerdem tragen sie die Fluoreszenzmarkierung, sodass jedes Fragment in der den jeweiligen Basen entsprechenden Farbe fluoresziert O 1 O O O-P-O-P-O-P-O-CH₂ 0 0 Base H (A, T, G oder C) H H H H Desoxyribonukleotid- HO H Triphosphat (dNTP) 5' ???????? ???? ?? ????? 3' ddCTP ddGTP ddTTP ddATP C TOR 5' T??? ??? ???? ?? ??????...

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3' 3' GCG 5' 5' T?? ?????? ???? ?? ?CGC 3' 3' AATC TGGGCTATTCGGGCG 5' 5' TT? ???????????? ?CGC 3' 3' ATC TGGGCTATTCGGGCG 5' Jeder Strang fluoresziert in der Farbe des jeweiligen ddNTP an seinem Ende. Die Farbe wird mit- hilfe eines Laserstrahls bestimmt. Die Sequenz des neu synthetisierten DNA-Strangs lässt sich nun ableiten... und in die Sequenz des Matrizenstrangs umwandeln. O Shos Primer O-P-O-P-O-P-O-CH₂ 0 5.H Didesoxyribonukleotid- HH Triphosphat (ddNTP) 0 Matrizenstrang (mit bekannter Sequenz) Durch die fehlende OH-Gruppe an der 3'-Position können keine weiteren Nukleotide angehängt werden. Laser O™ CO Base (A, T, G oder C) Elektro- phorese 3' OULUTATTUUU in H H größtes Fragment Fotozelle kleinstes Fragment 3' AATCT GGGCTATTCGG 5' 5' TTAGA CCCGATAAGCC 3'

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