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Leah
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-Plasmide -Herstellung eines Hybridplasmids -Gentransfer (Transformation, Transduktion, Konjugation) -Identifikation/Selektion klonierten Zellen (Transformationsnachweis, Rekombinationsnachweis)
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PLASMIDE (Vektoren) Plasmide -Bauterium. Ringformige DNA. Schematische Darstellung eines Plasmids mit Antibiotikaresistenzgenen: ● -Replications ursprung 1. und 2. Resistenzgen ÜBERBLICK Isolation + Identifizierung → mit. Gensonde • Rehombination • Gentransfer. Selection + Ulonierung HERSTELLUNG EINES HYBRIDPLASMIDS •Isolierung → Gens aus DNA des Spenderorganismus Restrictionsenzyme schneiden DNA in definierte Stücke Can. Sequenz CATCA → CA..... TCA) →→→Schnittstenen in Regel nicht nglatt" => "sticky ends" (überstehende Einzelstrange) gewünschte Gen → identifizier+ + isoliert von Gensonde Plasmide sind uleine, ring förmige selbstständig replizierende doppel- strangige DNA- Molehüle, die in Bauterien vorkommen tiönnen, aber. nicht zum Bakterien Chromosom zählen.. wenn gelungen Resistenz 2 Gewinnung eines geeigneten Plasmids als Velitor (=Genfähre): aus Bauterium wird Plasmid isoliert → geschnitten mit gleichem. Restriction senzym ↳gleiche ustichy ends" Hybridisterung/Einbau der Fremd-DNA' • Fremd-DWA und Plasmide (geöffnet) zusammengebrach+ + vermischt ↳ "sticky ends" fügen sich komplementar zusammen • Ligase verbindet. Enden Gentechnik Resistenz I → reuombiniertes Hybridblasmid ori => Reptilationsursprung C schneiden mit gleichem Restrictionsenzym. ergibt passende " Stichy; ends" : Aybridisierung rekombiniertes Hybridplasmid TRANSFORMATION Aufnahme von Fremd-DNA Behandlung mit CaCl₂ + Abuühlung/starkes Erwärmen sorgen for in Poren" in der B. zellwand. und begünstigen die Aufnahme (Stromstoße, Schrotschuss klonierung) ● · TRANSDUKTION übertragung von Genen mittels Viren (Virus als Genschleuser) : Viren befallen. Wirtszelle, übernehmen Stoffwechsel → Zusammenbau · Möglichkeit Stück. DNA- Plasmid von Bakterium eingebaut.. → Virus befant neven wirt → einschleusen der DNA sensibles Bakterium erhält plasmid mit Resistenz C пелеены пишешшшшки WORDE ● Gentransfer O Plasmabroche/ Sex-Pilus D KONJUGATION bertragung von Genen von zeme. zu. Zelle →über. Plasmabroche (instabil) 1. Balterium mit. Doppel-Resistenz plasmid bildet. Plasmabrüche. z. Bakterium ohne Resistenzplasmid 2....
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Plasmid teilt sich in 2 Einzelstränge →→ 1 Strang öffnet sich + wandert zur Plasmabrücke 3. Plasmidstrang wandert zum Baliterium ohne Plasmid → schließt sich dort wieder 4. DNA-Einzelstränge recuplizieren sich in beiden Batterien →→belde Bauterien haben nun Doppel-Resistenz plasmid. gegen = hat Fertilitat C @ 8 → hat nun auch Fertilitat F hann sich auch mit weiterem. FⓇ naustauschen." •selection for weiteres, z.B. Doppelresistenz deminutewwww v 2 Antibiotika. minutes Penanaman 3 BEDINGUNGEN. 1. war die Transformation erfolgreich → wurde ein Plasmid aufgenommen? 2. war die Recombination erfolgreich. wurde ein velitor mit der passagier-DVA eingebaut + richtige. Stelle? 3. worde das Insulingen so eingebaut, dass Insulin-mRNA transkribiert und Insulin hergestellt werden uann? I.. TRANSFORMATIONSNACHWEIS. Plasmid/Veltor mit Gien for Resistenz 2.B. gegen Tetracyclin zusätzlich eine weitere. Resistenz z.B.. Ampicilin ● O ・Insulin-Gen uopie Identifizierung/Selektion klonierter Zellen Linker mit stichy ends -aufgeschnittenes Gen for Ampicillin-Resistenz intautes Gen for Tetracyclin-Resistenz Bauterienstamme in Ampicillin Bauterien auf. Letracyclinhaltigen Nährboden → nur transformierte. Gene überleben haben Plasmid für die Resistenz Bauterien ohne Plasmid sterben ab. Original identifiziert Streptomycin. Actinomycin Bauterienholonie auf. normalem Nährboden 2. REKOMBINATIONSNACHWEIS -Oberlebende Bauterien werden weitergezüchtet Ampicillin-Resistenz →→→ Schnittstelle →→ Restrictionsendonucleasen dafür ausgewählt. (Mitte). resistent gegen. Tetracyclin aber nicht mehr resistent gegen Ampicillin O Bauterienuolonie auf Nahr- boden, der mit Tetracyclin versetzt worde Stempelte Chnili: Uople. Her Batterienholonie bevor Ampicillin ↳samtüberzogener Stempel auf. Petrischale mit Bakterien → einige Bakterien bleiben an samt nängen → Stempel in neue Betrischale Petrischale mit Ampicillin und kopie. → neve uolonien an gleicher stelle. ↳ entnehmen der Bakterien (Original), die bei Ampicilin abgestorben sind haben Insulingen in Mitte des Ampicillin-Resistenzgen => weine Resistenz mehr.
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Plasmid teilt sich in 2 Einzelstränge →→ 1 Strang öffnet sich + wandert zur Plasmabrücke 3. Plasmidstrang wandert zum Baliterium ohne Plasmid → schließt sich dort wieder 4. DNA-Einzelstränge recuplizieren sich in beiden Batterien →→belde Bauterien haben nun Doppel-Resistenz plasmid. gegen = hat Fertilitat C @ 8 → hat nun auch Fertilitat F hann sich auch mit weiterem. FⓇ naustauschen." •selection for weiteres, z.B. Doppelresistenz deminutewwww v 2 Antibiotika. minutes Penanaman 3 BEDINGUNGEN. 1. war die Transformation erfolgreich → wurde ein Plasmid aufgenommen? 2. war die Recombination erfolgreich. wurde ein velitor mit der passagier-DVA eingebaut + richtige. Stelle? 3. worde das Insulingen so eingebaut, dass Insulin-mRNA transkribiert und Insulin hergestellt werden uann? I.. TRANSFORMATIONSNACHWEIS. Plasmid/Veltor mit Gien for Resistenz 2.B. gegen Tetracyclin zusätzlich eine weitere. Resistenz z.B.. Ampicilin ● O ・Insulin-Gen uopie Identifizierung/Selektion klonierter Zellen Linker mit stichy ends -aufgeschnittenes Gen for Ampicillin-Resistenz intautes Gen for Tetracyclin-Resistenz Bauterienstamme in Ampicillin Bauterien auf. Letracyclinhaltigen Nährboden → nur transformierte. Gene überleben haben Plasmid für die Resistenz Bauterien ohne Plasmid sterben ab. Original identifiziert Streptomycin. Actinomycin Bauterienholonie auf. normalem Nährboden 2. REKOMBINATIONSNACHWEIS -Oberlebende Bauterien werden weitergezüchtet Ampicillin-Resistenz →→→ Schnittstelle →→ Restrictionsendonucleasen dafür ausgewählt. (Mitte). resistent gegen. Tetracyclin aber nicht mehr resistent gegen Ampicillin O Bauterienuolonie auf Nahr- boden, der mit Tetracyclin versetzt worde Stempelte Chnili: Uople. Her Batterienholonie bevor Ampicillin ↳samtüberzogener Stempel auf. Petrischale mit Bakterien → einige Bakterien bleiben an samt nängen → Stempel in neue Betrischale Petrischale mit Ampicillin und kopie. → neve uolonien an gleicher stelle. ↳ entnehmen der Bakterien (Original), die bei Ampicilin abgestorben sind haben Insulingen in Mitte des Ampicillin-Resistenzgen => weine Resistenz mehr.