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von Stoffgemischen unter dem Einfluss eines elektrischen Feldes - mit der 6. Können Protein- & Nucleinsäuregemische in ihre Komponente zerlegt werden (Auftrennung nach Masse & Ladung) - am Ende der G. liegen Moleküle gleicher Molekülmasse in der selben Zone des Gels -> nach Anfärben sichtbar als Banden ANWENDUNG: PCR vervielfältigt minimale DNA-Sequenzen METHODE: - ein PCR-Ansatz enthält: die Proben-DNA, ausreichend Nucleotide (A,T,G,C), hitzestabile DNA- Polymerase & zwei DNA-Primertypen - diese legen durch ihre Basensequenz den Startpunkt auf beiden DNA-Einzelsträngen für die Polymerase fest - das grenzt den zu vervielfältigenden Bereich von beiden Seiten aus ein Ein PCR-Zyklus besteht aus drei Schritten: a) Denaturierung b) Hybridisierung c) Verlängerung. PCR-Ansatz gewünschtes Fragment 3' 3 DNA-Primer / •>> METHODE PCR NACH KARY MULLIS <<< . 1. PCR-Zyklus Denaturierung bei 94 °C 5' 3' T Nucleotid 3' 5' Hybridisierung bei 50-60 °C 5' 3' Es sind zwei verschiedene Primer erforderlich: einer für jeden DNA- Strang. Sie werden von Firmen mit der Wunschsequenz geliefert. 5' 3′ 5' Rückwärts-Primer Vorwärts-Primer 5' Verlängerung bei 68-72 °C 5' 3' 3' 5' 5' 3' 3' Die Primer bestimmen nur die Startpunkte. Daher werden die ersten DNA-Kopien am 3'-Ende oft länger als gewünscht. 2. PCR-Zyklus 3' 3' 3. PCR-Zyklus Bei weiteren PCR-Zyklen entstehen dann Kopien des gewünschten Fragments in der richtigen Länge. Methode normale Nucleotide (A, T, G, C) 3' 5' P-P-P-CH₂ Menge: 200-fach DNA-Primer Die Reaktion ist eine PCR-Variante (014.1), jedoch mit nur einem Primer anstatt zwei. >> Im elektrischen Feld wan- dern DNA-Fragmente umso schneller durch das Gel, je kürzer sie sind. Das sortiert sie nach Größe. Kapillar-Elektrophorese H O H + OH 0. Sequenzierung der DNA H H Base G" C G* A* A* H G Tº •>> METHODE Die DNA-Sequenzierung nach Frederick Sanger Auftragungsort des Fragmentgemischs Menge: 1-fach Ab hier wird die Sequenz ermittelt. 5' DNA- -Polymerase -Kapillare -Gel Kettenabbruch-Nucleotide (A", T*, C", G") Fluoreszenzdetektor Α' T Gº C* >> P-P-P-CH₂ Fehlen der OH- Gruppe führt zu H Kettenabbruch. 5' einzelsträngige DNA (Matrize) H H www 0 Durch 200-fachen Überschuss normaler Nucleotide ist der Einbau eines Kettenabbruch- Nucleotids ein seltener Zufall. Detektor-Ausgabe H Nach A, T, G", C* bricht die Synthese jeweils ab. Es entsteht ein wirres Gemisch aus verschieden langen DNA-Fragmenten. Am zugehörigen Farbsignal von A, T, G", C* lässt sich eine Sequenz ablesen, die komplementär zum Matrizenstrang ist. TGCA AGC G H 3' Base H DNA auf 4 Ansätze verteilen MODERNES VERFAHREN << Unbekannte DNA erhitzen, damit die Doppelstränge getrennt werden << mit DNA-Sequenzierung kann man die Basenabfolge eines DNA-Abschnitts ermitteln Aufzeichnen durch einen Drucker - klassisches & modernes Verfahren beruhen auf der Kettenabruchmethode nach Sanger - Anwendung der Kettenabruchmethode: liefert die Basensequenz beliebiger DNA- Fragmente -> kurze Sequenzen können zu langen Sequenzen zusammengesetzt werden -> Aufklärung ganzer Genome -> DNA-Sequenzen liefern u.a. Informationen über Gene, Mutationen und Aminosäuresequenzen Nucleotide der vier Basen, Primer, Polymerase und jeweils ein fluoreszenzmarkiertes Didesoxynucleotid zugeben ↓ Primer und Nucleotide lagern sich an Einzelstränge an Anlagerung von Didesoxynucleotiden führt zu Kettenabbruch Auftrennung der DNA-Fragmente durch Gel-Elektrophorese DNA-Stücke laufen aus dem Gel und passieren einen Detektor der die Fluoreszenzmarkierung erkennt - jedes der 4 Desoxynucleotide wurden mit einer anderen Farbe markiert -> können alle im selben Ansatz vorliegen - je länger ein Abschnitt, desto später kommt der beim Detektor an