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Grundoperationen der Gentechnik

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Grundoperationen der Gentechnik

 SCHNEIDEN VON DNA
Das Schneiden der DNA geschieht mithilfe von Restriktionsenzymen (Restriktionsendonucleasen)
•Restriktionsenzyme werden a

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•Schneiden •Überagung von DNA •Selektion

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SCHNEIDEN VON DNA Das Schneiden der DNA geschieht mithilfe von Restriktionsenzymen (Restriktionsendonucleasen) •Restriktionsenzyme werden aus Bakterien gewonnen Bakterien schützen sich mit ihnen vor eingedrungener Fremd-DNA-> Enzyme zerschneiden Sie "Restriktion der Fremd- DNA Jentechnik GRUNDOPERATIONEN *RE schneidet DNA nur an einer Stelle die as anhand einer spezifischen Bosensequenz erkennt • eine konkrete Region der DNA wird von einem RE immer in die gleichen Fragmente zerlegt je nach Enzym schneiden RE die doppelsträngige DNA in Fragmente mit glattem Ende (blunt ends)oder mit versetztem Ende (sticky ends) •Jede DNA die mit dem gleichen RE geschnitten wurde weist die gleichen sticky ends auf DNA Bruchstücke können zusammengefügt werden ↳ Spender-DNA wird in die Lücken des Vektors eingefügt indem sich die passenden Einzelstrangenden aneinander Lagern und durch DNA-Ligase verbunden werden SCORI RES Hoell GTTAAC CAATTG | |_| CCG G 4 Substratspezifitāt = UO Enzyme schneiden jedes Enzym spaltet die DNA an einer bestimmten Schnittstelle Lydiese erkennt' sie an der DWA-Sequenz • Erkennungssequenzen sind symmetrisch Dirkungsspezifitāt = wie Enzyme schneiden (sticky/blunt-ends) RE spalten die Zucker-Phosphat-Bindungen in beiden DNA-Strängen Sie schneiden immer zwischen den gleichen Nucleotiden .schneider zwischen nicht komplementären Basen. Schnittstellen sind versetzt => Sticky ends (klebrige Enden) · Schneiden Zwischen zuei komplementären Basen: Schnittstellen liegen auf beiden Strängen gegenüber => blunt ends (glatte Enden) -MÜMˇˇˇˇNAR. L 6 | CAATT TUNNUUM T = A A ત્ ત્ GG G ÜBERTRAGEN VON DNA Rekombinante DNA kann nur in Genprodukte umgesetzt werden, wenn Sie in eine Wirtszelle gelangt. Für die Übertragung werden meist Vektoren genutzt. Vektoren Apr or: Schnittstelle...

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für RE Promotor Operatorgene Plasmide PBR322 -ori (Replikationsursprung) ·Ampicillin-Resistenz gen Tetracylin-Resistenzgen Schnittstellen Pst 4, Hindi, BamHI,EcoRI Eigenschaft replizierbar Chat Replikationsursprung Markergene -> Antibiotikaresistenz -> Forbstoffsynthese PUC: hohe Kopieanzahl pro Zelle (schnell große Mengen des Plasmids ·Anstatt Tetracylin: Enzym für katalyse eines farblosen Substrats in blaues Produkt-> Farbnachweis Ti Plasmid tumorinduzierende Gene Gene, die den Transfer der Tumorinduzieren den Gene in das Genom der Wirtspflanze Ersatz der tumorinduzierenden Gene durch Fremd-DNA stevern •Nutzung des Ti-Plasmids für die Obertragung neuer Gee in Pflanzengenome, ohne dass es zur Tumorbildung kommt -Nachteil: Ti-Plasmid ist auf zweikeimblättrige Pflanzen spezialisiert Direkte Genübertragung = direkte übertragung von Genen in eine Zelle Aps Begründung Bei der Vermehrung der DNA muss die Fremd DNA ebenfalls repliziert werden Überprüfung in den Plasmid erfolgreichen Übertragung der Gene Resistenz gegen ein Antibiotikum zeigt (nicht) Einbau an Farbe als Nachweis des Vorhandenseins des Gens Aufschneiden von Plasmiden zum Einbau der Fremd-DNA Anlagerungsstelle für die DNA-Polymerase Anschalten der Transkription der Gene ·Polyethylenglykd (PEG): erleichtert Aufnahme von DNA über die Zellmembran Elektroporation. Anlegung einer hohen Spannung für wenige Millisekunden ->go on istehen Doren in der Membran bei Bakterie- und Tierzellen die Fremd-DNA eingeschleust wird • Liposomen· künstliche Vesiket, die schnell mit der Zellmembran verschmelzen Tiezellen => Bei den 3 Varianten muss die rekombinante DNA bei Eukaryoten während der Mitose oder durch aktiven Transport in den Zellkern gelangen damit das Transgen in das Genom integriert und weitergegeben werden kann Plasmid mit Fremd-DNA Ori Viren • Verwendung von modifizierten Retro- vieren zum Gentransfer auf Tierzellen Erge aus RNA wird in Zelle • mit Hilfe von reverser Transkriptase wird aus mRNA (durch umgekehrte Transkription") eine DNA (CDNA copy-DNA) hergestellt • Partikelbeschuss mit Genkanone: Linzige Gold-/Wolframkügelchen werden mit Fremd-DNA überzeugen und mit hoher Geschwindigkeit in die Zellegeschossen, Teil brifft die Zellkerne PBR 322 durch Integrase wird der neue Gen- abschnitt i chohimchert der Wirtszelle -Mikroinjektion: Frend-DNA wird mit Hohloader oder Mikrokapillare in den Zellkern injeziert L>Tierzellen • auch für einkeimblättrige Pflanzen geeignet • Eignung für Tierzellen Te Tcr Bahromosom Plasmid mit Frend-DNA Plasmid ohne Fremd-DNA Um fremde DNA in eine Zelle zu übertragen sind folgende Grundschritte notwendig: • DNA aus dem Spendeorganismus wird isoliert und mithilfe eines Enzyms in Fragmente zerlegt •Zur Obertragung der Spender-DNA wird ein Transportmolekül benötigt, ein Vektor. Die Vektor-DNA wird mithilfe des gleichen Enzyms aufgeschnitten, sodass sich die Spender-DNA anlagern kann. •Mit dem Enzym DNA-Ligase werden die beiden DNA-Moleküle verbunden Ding brusammengefügte, sogenannte rekombinante DNA wird in die Zelle eines Empfängerorganismus SELEKTION TRANSGENER ZELLEN Da weder die Integration von Fremd- DNA in den Vektor, noch die Aufnahme der Vektor-DNA in die Zelen immer erfolgreich ist, müssen diejenigen Zellen, die das Gen aufgenommen haben, selektiert werde Transformation •Bei der Übertragung von DNA ouf Plasmide entstehen im Reagenzglas Plasmide mit und ohne Fremd-DNA •Mischung mit DNA- Ringen wird zu einer Kultur von Empfängerzellen gegeben Selektion Auslesung von E.Coli-Zellen, die überhaupt ein Plasmid aufgenommen haben. • kultivierung der Bakterien auf tetracylinhaltigem Nährboden alle Zellen, die kein Plasmid aufgenommen haben sterben ab •Zellen mit Plasmid wachsen wegen der Tetrocylinresistenz zu Kolonien Auslesung von E.Coli-Zellen, die ein Plasmid mit Fremd-Gen aufgenommen haben: •Kopie . Dort können nur der Bakterienkolonien wird mit einem Samt stempel auf einen ampicillin haltigen Nährboden übertragen Bakterien mit Plasmiden ohne Fremd-DNA kolonien bilden L> Grund: Fremdgen hemmt ampicillin-resistenz •Durch einen Vergleich beider Nährboden können die Bakterien mit Fremdgen identifiziert werden Farbnachweis • bei PUC-Plasmiden ersetzt enzymatisch katalysierte Farbnach weis den Stempelschritt • Einbau der Fremd-DNA erfolgt in die Stelle die für das Enzym Codiert auf ampicilinhaltigem Boden bilden alle Bakterien mit Plasmid kolonie nu Bakterien ohne Frend-Gen setzen das Substrat um und werden blau Bakterien- Kolonien o o o O 50 o O O Medium mit Tetracylin¹ Selektion von Bakterien mit Plasmid o O O C O O 9 00 9 o Medium mit Ampicillin Selektion von Bakterien ohne Fremd - DNA

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So ein schöner Lernzettel 😍😍 super nützlich und hilfreich!

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