Grundoperationen der Gentechnik

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der erfolgreichen Übertragung der Gene Resistenz gegen ein Antibiotikum zeigt (nicht) Einbau an Farbe als Nachueis des Vorhandenseins des Gens Aufschneiden von Plasmiden zum Einbau der Fremd-DNA Anlagerungsstelle für die DNA-Polymerase Anschalten der Transkription der Gene Plasmide Ap P82322 ori (Replikationsursprung) ·Ampicillin-Resistenz gen Tetracylin-Resistenzgen Schillstellen Psta kindel, BamHI, EcoRI PUC: -hobe kopieanzahl pro Zelle (schnell gegen des Plos Anstall Enay für katalyse eines Substrals in blares Produki-> Farbnachus farblosen T: Plasmid tumorinduzierende Gene Geegi den Transfer der Tumorinduzieren den Gene in das Genom der Wirtspflanze steuern Ersate der tumorindugierenden Gene durch Fremd-ONA -Nutzung des Ti-Plasmids für die Übertragung in Pflanzengenome, ohne dass es zur Tuning neuer Gene Nachleil Ti-Plasmid ist auf zumkeimblättrige Pflanzen spea: alisiert Direkte Genübertragung direkte übertragung von Gemen in eine zelle D'G Polyethylenglyked (PEG) erleichtert Aufnahme von OWA über die Zellmembran Elektroporation. Anlegung einer hohen Spannung für wenige Millisekunder fra de frend-DNA angeschleust wird Lobei Bakterien- und Tierzesen -Liposomen künstliche Vesiket, die schnell mit der Zellmembran verschmelzen Plasmid mik Viren Verwendung von modifizierten Retro- vieren zu Gentransfer auf Tierzeten => Bei den 3 varianten muss die rekombinante DNA bei Eukaryoten während der Milose oder dich aktiven Transport in den gelangen damit das Transgen in das Genom integriert und weitergegeben werden kann Fremd-ONA •Erbsubst. 01 engeschich aus RNA wird in Zelle ·Partikelbeschuss mit Genkanone Linzige Gold-/Wolframkügelchen werden mit Fremd-DNA überzeugen und mit haber Geschwindigkeit in die zelegescheuen, Teil brifft die Zelkene ·Mikroinjektion: Fiend-ONA Lindmil Hohleade oder Mikukapillare in den Zellkern injeziert L>Tierzen PBR 322 • mit Hilfe von reverser Transkripiose dous mENA (durch, umgekehrte Transkriplignenc DNA (CONA. COP-ONA) hergestell Ter •durch Integrase wird der neue Gen- Urtste Chromosom, der szele stabilisiert auch für einkeimblättrige Pflanzen geeignet Eignung für Tiersellen Bakterien Chomo.com Plasmid ohne Tiemd-DNA Um fremde DNA in eine Zelle zu übertragen sind folgende Grundschritte notwendig: • DNA aus dem Spendeorganismus uird isoliert und mithilfe eines Enzyms in Fragmente zerlegt •Zur Obertragung der Spender-DNA wird ein Transportmolekúl benötigt, ein Vektor. Die Vektor-DNA Lird mithilfe des gleichen Enzyms aufgeschnitten, sodass sich die Spender-DNA anlagern kann. Mit dem Enzym DNA-Ligase werden die beiden DNA-Moleküle verbunden gebrachsammengefagle, sogenannte rekombinante DNA wird in die Zelle eines Empfängerorganismus SELEKTION TRANSGENER ZELLEN De ueder die Integration von Fremd-DNA in den Vektor, noch die Aufnahme der Vektor- DNA in Zelen erfolgreich ist, müssen diejenigen Zellen, die das Gen aufgenommen haben, seiekliert werden Transformation Bei der Übertragung von DNA ouf Plasmide entstehen im Reagenzglas Plasmide mit und ohne Fremd-DNA Mischung mit DNA-Lagen Lird zu einer Kultur von Empfängerzellen gegeben Selektion Auslesung von E.coli-Zellen, die überhaupt ein Plasmid aufgenommen haben. • kultivierung der Bakterien auf tetracylinhaltigem Nährboden olle Zellen, die kein Plasmid aufgenommen haben sterben ab -Zellen mit Plasmid wachsen wegen der Tetracylinresistena zu Kolonien Auslesung von E.coli-ballen, die ein Plasmid mit -Gen aufgenommen haben: Samt Dort können nur Bakterien mit Plasmiden ohne Fremd-ONA kolonian licillin haltigen Nährboden übertragen L, Grund am Durch einen Vergleich beider Nährboden können die Bakterien mit Frendgen identifiziert werden Farbnachweis bei PUC-Plasmiden ersetzt enzymatisch katalysierter Forbrach was den Stempelschritt Einbou der Fremd-DNA erfolgt in die Stela die für das Enzym Codiert auf ampicainhaltigem Boden bilden ale Bakterien mit Plasmid kolonia -nu Bakterien ohne Frend-Gesetze das Substrat um und werden blau Bakonen O O O C 00 Medium mit Tetracylin Selektion mit Plasmid Bakterien von O O 0 O O Medium mit Ampicille. Selektion von Bakterien ohne Fremd- ONA