Methoden der Gentechnik

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UNEL ST SEBU YURAKUCHÓLME 江古田 SHIN-EGOTA SASAZUKA NAKAI CHIA 19 KU ENKAWA HIGASHPJUR CHUO LINE NAKANO W KANAMECHO NAKANO NISHI- SAXAUE SHINJUKU PHLE HATAGAYA C ITOKYÚ TOKYU MEGURO LINE MEJIRO TOCHO MAE ESTA CIMACHI LINE SHN- OKUBO YOYOGIKOEN 代々木公園 YOYOGI PREZEN TAKADAMO BABA ame HATSUDA NISHIGUCH G Pra IKEBUKURO HIGASHI: IKEBUKURO NAKA MEGURO POR WASEA GAR-BIROUR YONCHOME WHANTH SHINJUKUSHINJUKU FREE WASEDA KAGURAZAKA GOME KAGURAZAKA JR SHINJUKU JAY LINE SHINJUKU P HARAJUKU FIOT SEBU SHIBUYA mu HIGASHI SHINJUKU YOYOGI Z SHINJUKU 615 WAKAMATSU- KAWADA 若松河口 EBISU BTSUKA 大学駅 USHIGOME YANAGICHO NEL KYOGIJO INGINAF GEL 9300 GOKOKUJI OWOTE SANDO M EDOGAWA BASHI KOKURITSU IIDABASHI YOTSUYA SANCHOME BETE MEGURO AKEBONO BASHR 19 SHIKOJKU SANCHOME SHKU GYOEMMAE ICHIGAYA 1828 SENDA GAYA SHINAND NACH SHIN-OTSUKA ADYANA UTCHOWE VISIT YOTSUYA Ave NOGIZAKA GAIEMMAE AR 820 SUGAMO ww MYOGADANI SECAR KOJIMACHI 35 TI TOZAL LINE S SHINJUKU LINE KUDAN NAGATACHO AKASAKA MITSUKE BARK AKASAKA SHIROKANEDAI ROPPONG JUKK HIRO-O 15.6 SENGOKU HAKUSAN ORAKUEN B SHIROKANE TAKANAMA CARN KOMAGONE 1963 KASUGA WA HANZOMON ROPPONGI- ITCHOME AK-TB *R658 TODAIMAE SUIDOBASHI HONKOMAGOME TAMEIKE SANNO CHIE TABATA WERT HONGO SANCHOWE 131 TAKEBASHI OY YURAKUCHO LINE SAKURADAMON HHIBIYA LINE AZABU- JUBAN HONGO SANCHONE OCHANO MIZU JIMBOCHO KOKKAI KASUMIGA GJIDOMAE SEKI RISATE HOM Transfer OMITA LINE KAMIYACHOM TORA NOMON AKABANEBASHI FER SHIBAKOEN 艺公司 MITA NISHI- NIPPORI AC SENDAGI NEZU 673 EOEDO LINE YUSHIMA SHIN- OCHANOMIZU CHR/K HIBIYA OGAWA MACHI ONTO ÕTEMACHI 大手町 AWAJICHO BORET IMMAR HOUCH UNE TAMACHI NIPPOR UCHISAIWAI CHO PAST ONARIMON HEARTS DAIMON 大門 NUOBASHI TOKYO 5800 ww YURAKUCHO HANUUMATSU * UENO- OKACHMACHI MENENT UENQOKACH KANDA SUEHIROCHO TOKYO MONORAIL UGUISUDANI GINZA WA SHIMBASHI UENO 2.99 TH GINZA-ITCHOME NAKA MACHI OKACH AKHABARA WAMOTO CHO WART SHIN 10 H KYOBASHI FUN SHIODOME 350 MITSUNDSHI WAE 「MINOWA 三ノ輪 IRIYA AB INARICHO KURAMAE MACH Transfer KURAMAE TSUKIJI RA JYURIKAMOME SHIN OKACHIMACHI MINAMI SENJU 用千位 TAWARAMACHI TAKARACHO HIGASHI GINZA SHINTOMICHO MEA BAKUROCHO NOURRY Z HANZOMON LINE NIHOMBASHI ** FOX NHOMEASH CHEED ASAKUSA RYOGOKU BASHI KODEMMACHO PENE HINGYOCHO AMET MICHO HATCHO TSUKISHINA FLM "HONJO- ASAKUSA AZUMABASHI XW * Transfer RYOGOKU TOEI LINE ZOSHIAGE HAMACHO SAR KAYABACHO MONZEN KACHIDOKI TSUKIJISHIJO mee TOYOSU TATSUMI BM We *ORR SUITENGU MAE INCESSILINE JJR SOBU LINE LÕEDO LINE IM ORSH TẢ RT BORIBA KIYOSUN IMA CRAFT 新木場 SHIN-KIBA KIMSHICHO AME KIKUKAWA SUI TOBU KAMEDO LINE SUMIYOSHI GN TOYOCHO SUBWAY SHINOZAKI MIZUE ICHINOE UNABORI IKEISEI LINE MINAMI GYOTOKU GYOTOKU KEISEI YAWATA REN ← MINAMI-SUNAMACHI HIGASHI-OJIMA t OJIMA NISHI-OJIMA MOTO YAWATA BUCH -NAKAYAMA 典。 MYÖDEN NISH FUNABASH URAYASU NISHI-KASAI 3575 KASAI JR KETYÖ LINE MAP TOKYO METRO LINE GINZA LINE O IHURUSU LINE NARITA AIRPORT NARITA KUKO SHIBAYAMA LINE Bureau of Transportation. Tokyo Metropolitan Government. TOYO RAPID LINE Gekoppelte Gene Treten gemeinsam auf / in einem Chromosom Werden gemeinsam vererbt, wodurch 3 Mendelsche Regel ungültig ist: Kreuzt man zwei Rassen, die sich in mehreren Merkmalen unterscheiden, so werden die einzelnen Erbanlagen unabhängig voneinander vererbt. Diese Erbanlagen können sich neu kombinieren. ► Je näher die Gene beieinander liegen Nicht gekoppelte Gene Treten nicht gemeinsam auf Je weiter die Gene voneinander entfernt sind oder sogar in einem anderen Chromosom liegen. Physikalische Kartierung Methoden der Cytogenetik & Gentechnologie Ziel: Vollständige Sequenz eines Chromosoms zu erlangen also die Reihenfolge der DNA-Sequenzen herauszufinden. Voraussetzung: Man benötigt Marker = DNA-Sequenzen bzw. markierte Gene, die mikroskopisch sichtbar gemacht werden. I. DNA-Fragment länge II. Mikrosatelliten (STR) III. Gen Sonde Marker (Theorie) DNA-Fragmentlänge •Mithilfe von Restriktionsenzymen wird Länge von 20 000 KB herausgeschnitten Molekularschere Mikrosatelliten (STR) •Feinere Kartierung von 600 KB •Kurze Wiederholungssequenze n SNP's •Sind meist Punktmutationen, wodurch man den Marker besser finden kann. Schnitt durch Restriktionsenzym wird verhindert oder ausgelöst. Gensonde •100 KB= c.a 60 Gene Wird hybridisiert also komplementäre Basensequenz angehängt und Gen kann identifiziert werden. Marker: DNA-Fragmentlänge Restriktionsenzym Restriktions- fragment der Lange 20 000 kB (Kilobasen) Verlauf am Beispiel des Brustkrebsgens Chromosom 17 80 000 kB Im Genom vieler an Brustkrebs erkrankter Per- sonen schneiden Restriktionsenzyme aus mosom 17 Fragment bestimmter Länge. Marker: Mikrosatelliten AT 600 kB -Mikrosatellit 1 Mikrosatellit 2 Innerhalb dieses Fragments finden sich bei Erkrankten Mi- krosatelliten gleicher Länge. Marker: Gensonde 100 kB DNA-Abschnitt mit Brustkrebsgen RNA DNA Ein Abschnitt dieser DNA hybridisiert mit der RNA aus Brustkrebszellen. Ein Gen (hier „Brustkrebs-Gen") lässt sich durch schrittweise Eingrenzung des Chromosomenbereichs kartieren. DNA Hybridisierung 2309 Was ist DNA- Hybridisierung? Es ist eine Methode der Gentechnik Zwei Einzelstränge der DNA werden über Wasserstoffbrückenbindungen zu einem Doppelstrang verbunden ▶ Nur möglich, wenn die Einzelstränge eine komplementäre Basensequenz haben Mensch Schimpanse Trennung der H-Brücken ca. 88° C schmelzen" Hybrid-DNA schmilzt bei ca. 86° erwärmen Schmelzpunkt früher, da zwischen den Strängen der Schimpansen- und Menschen-DNA weniger H-Brücken möglich waren. Trennung der H-Brücken Einzelstränge abkühlen дить Abschnitte, wo -keine Basenpaarung möglich ist, da versch. Basensequenz komplementäre DNA Basenpaarung möglich = Hybrid-DNA Ablauf Die DNA wird denaturiert, wenn die doppelsträngige DNA auf über 90˚C erhitzt wird ▸ Diese zerfällt in Einzelstränge Je höher dabei die Anzahl der bereits bestehenden komplementären Basenpaare innerhalb der Stränge ist, desto höher muss die Schmelztemperatur sein Das Abkühlen mit einer Temperatur von mindestens 25°C unter dem Schmelzpunkt führt zur Renaturierung (die Stränge können sich wieder verbinden) Je mehr Basenpaare zwischen den Strängen komplementär sind, desto mehr Wasserstoffbrückenbindungen werden bei der Renaturierung zwischen den Nucleinbasen ausgebildet (festigen und stabilisieren den Hybridstrang) Während der Hybridisierung werden Sonden eingesetzt und vor der Hybridisierung in der Regel mit einem fluorierenden Farbstoff versehen oder radioaktiv markiert Vorteile und Nutzen der Hybridisierung Dient zur Isolierung spezifischer Nukleinsäuresequenzen aus einem Gemisch Es kann erforscht werden, wie hoch der Anteil von sich wiederholenden DNA- Sequenzen ist Die Lage und Länge des codierenden Bereichs eukaryotischer DNA kann durch mRNA-Hybridisierung aufgeklärt werden Mithilfe von Sonden lassen sich das Vorkommen und die Lage spezifischer Sequenzen auf unterschiedlichen Chromosomen ermitteln Durch die sogenannte Blotting-Technik können mithilfe von Sonden gelektrophoretisch aufgetrennte DNA-Fragmente lokalisiert und identifiziert werden Die Hybridisierungstechnik gewinnt zudem zunehmend in der neurobiologischen Forschung, z.B an Hirnschnitten, an Bedeutung 2 3 Southern-Blotting-Technik Southern-Blotting-Technik Einsatz, um Gene oder andere DNA-Abscnitte zu analysieren, ohne die gesamte DNA zu isolieren 1. Die DNA wird durch Restriktionsenzymen gespalten 2. Die Fragmente werden gelelektrophoretisch getrennt 3. DNA wird denaturiert und auf nitrocellulose Membran übertragen (Blotten) 4. Nun werden Sonden eingesetzt 5. Dann kommt man zur eigentlichen Hybridisierung der Sonde mit komplementären Fragment 6. Die nicht gebundenen Sonden werden augewaschen und die Lage der gesuchten DNA-Banden durch Radioaktivität der Sonden oder Fluorizent bestimmt DNA Chips Genchips, Microarrays Was sind DNA-Chips? Auch Genchips oder Mikroarrays genannt Kleine Plättchen aus Glas, Plastik, Silikon oder Gold Chipoberfläche in Zellenraster unterteilt (daher,,arrays" = Raster Nebeneinandergereihte DNA-Fäden Aus der mRNA des Testgewebes wird mittels Reverser Transkriptase cDNA hergestellt und mit unterschiedlichen Fluoreszenzmarkern gekoppelt. Gewebe A Gewebe B mRNA reverse Transkription und Fluoreszenzmarkierung mRNA cDNA cDNA Anwendungen und Methoden der Gentechnik In jedem kleinen Feld ist die einzelsträngige DNA-Sequenz eines ande- ren Gens fixiert, die mit passender cDNA hybridisiert. Ein Computer wertet die Lichtsignale aus. Rot bedeutet hier, dass das entspre- chende Gen in Gewebe A aktiv ist, blau in Gewebe B, gelb in beiden. Hybridisieren und Abspülen hybridisierende CDNA 200 00000 Chips mit so wenigen Feldern wie hier, aber auch mit mehreren Millionen Feldern sind in Gebrauch. 0Q000 2 Jeder Farbpunkt auf einem DNA-Chip mit bekannten DNA-Sequenzen zeigt die Hybridisierung mit cDNA. DNA-Chip Chip-DNA the 1. In jedem Feld ist die einzelsträngige DNA der zu untersuchenden DNA. 2. mRNA einer Krebs und normalem Gewebe wird isoliert 3. Mithilfe von reverse Transkriptase wird cDNA (Chip-DNA) hergestellt & mit Fluoreszenzmarkern gekoppelt. 4. cDNA der beiden Geweben wird gemischt zusamen über den DNA-Chip gesrpitzt & abgespült 5. Computer analysiert mit Lasern die Farbverhältnisse Lichtsignal: Rot = Gen in Gewebe A aktiv / Blau= Gen in Gewebe B aktiv Gelb = Gen in beiden Gewebe aktiv - also höheres Risiko der Ausbildung von Krebszellen. Ablauf der DNA-Microarray Gewebe A (normal)= rot Gewebe B (krank)= blau Chancen Genaue Krankheitsursachen ► Diagnose von genetisch bedingten Krankheiten Nachweis von Gendefekten/Genvarianten ► Gerichtsmedizin (genetischer Fingerabdruck) Individuelle Arzneimittel Risiken Missbrauch durch Arbeitsgeber und Versicherer (Genchips würden Anfälligkeiten für bestimmte Krankheitenpreisgeben) ACGCCATTGAATGCCATOGGATGAT CATA ™M DNA- SEQUENZIERUNG Was ist die DNA-Sequenzierung? Feststellung der Abfolge der Basen eines DNA-Moleküls. soooooo TOA مهمومه START Primer START Dendurierung Primerhybridisierung Elongation DNA +Stop Dendurierung DNA-Sequenzierung Go Protein Polym merase 2 Gelelektrophorese Musse DETEKTOR COMPUTER ANTPS Resultate ddNTPs lehended 10 20 TACGGCAATGGTCTT ATT TCC+... Vorteile Hilft bei der Diagnose von Krankheiten Identifizierung der veränderten DNA-Sequenzen Bekämpfung von Resistenzen Bestimmung der Verwandtschaft von Organismen Information über die Evolution von Organismen 110 IGA AAGAGAGAAAAAGT TCAG TT TTACACA TCT TTATATGAAGCAG wwwwwwwwwwwwwwwww 230 "T TGTCATAATCATAAAGTTGTCA CAG TA TATT TCAAA CCAAC wwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwww GCT TO CCTG GTG GCTCAG GG GTAAAA A ACTCGC CCGCC COM www.wm wwwwwww 410 \TGAAAAAC CACTCTAG TATTCT TGC CTG GGA A AT www 490 Whims 150 TO GACATO ACTAAACAACAACATATAAAAT ACCT T илив 580 wwwwww 570 STAT TAACT TTTATG GT TA AATATAACCTANGCACTGT Ablauf PCR Benötigt wird genügend DNA, die bekommt man durch PCR (Polymerase Chain Reaction) Doppelhelix wird aufgetrennt und die Enzelstränge werden zur Vorlage für neue DNA-Doppelstränge. Ablagerung der zugegebenen Primer an die komplementäre Einzelstränge der DNA. Das Enzym DNA-Polymerase baut Stück für Stück eine neue DNA- Doppelhelix auf. Methode: PCR, Polymerasekettenreaktion (K. B. MULLIS, Nobelpreis 1993) Anwendung Die PCR vervielfältigt minimale DNA-Spuren. Methode Ein PCR-Ansatz enthält die Proben-DNA, ausreichend Nucleotide (A, T, G, C), hitzestabile DNA-Polymerase und zwei DNA-Primertypen. Diese legen durch ihre Basensequenz den Startpunkt auf den beiden DNA-Einzelsträn- gen für die Polymerase fest. Das grenzt den zu vervielfältigenden Bereich von beiden Seiten aus ein. Ein PCR-Zyklus besteht aus drei Schritten: @Denaturierung, Hybridisierung, Verlängerung. Ⓒ PCR-Ansatz interessierender DNA-Abschnitt wwwwwwwww 3′ " DNA-Primer a „Schmelzen", Denaturierung 5' bei 94 °C 5' wwwwww 3' Nucleotid 3′ PCR-Zyklus 6 Hybridisierung bei 50-60 °C 5' Der Primer bestimmt nur den Anfangspunkt. Daher sind die ersten DNA-Kopien oft länger als der interessierende Abschnitt. 5' HHH 3' Verlängerung bei 68-72 °C 5' www 3' 3' Bei den weiteren PCR-Zyklen entstehen schließlich Kopien, die genauso lang sind wie der interessierende DNA-Abschnitt. THIIHHHHH! abo HHHHHHHHH Nach etwa 35 Zyklen liegen genügend Kopien des interessierenden DNA- Abschnitts für eine weitere Analyse vor. Die Kettenabbruch-Methode ▸ Zusätzlich werden vier spezielle Stopnukleotide in die PCR-Reaktion gegeben ( jedes ist mit einem unterschiedlichen Farbstoff gekoppelt). Sie können nur an einer Seite mit einem anderen Nukleotid verknüpft werden. Wird einer von diesen Stopnukleotiden angefügt, bricht die Synthese an dieser Stelle ab. So entstehen viele unterschiedlich lange DNA-Stücken. Die unterschiedliche DNA-Stücke werden in eine Kapillare gegeben, wo die der Größe nach durchlaufen. An einer Seiten von der Kapillare ist ein Laser, welches die Farbstoffe der Stücke anregt. Ein Detektor erkennt die Reihenfolge der Farbstoffe und das entspricht der Reihenfolge der Nukleotide im ursprünglichen DNA-Molekül. Definition von Begriffen Gensonden: Das sind markierte DNA-Abschnitte, die in eine Mischung verschiedener DNA-Moleküle gegeben werden Sonden/Marker: Es sind zur Hybridisierung eingesetzte Sequenzen Hybrid: Ist in der Biologie ein Individuum, das aus einer geschlechtlichen Fortplanzung zwischen verschiedenen Gattungen, Arten, Unterarten, Ökotypen oder Populationen hervorgegangen ist Blotting: Es ist in der Molekularbiologie ein Verfahren zum Transfer von Molekülen wie DNA, RNA oder Proteine auf eine Membran Gelektrophorese: Es ist ein Verfahren mit dem man Moleküle voneinander trennen und sichtbar machen kann Restriktionsenzyme: genauer auch Restriktionsendonukleasen (REN), sind Enzyme, die DNA an bestimmten Positionen erkennen und schneiden können. Restriktionsendonukleasen treten unter anderem in Bakterien und Archaeen auf und dienen dort der Abwehr von Bakteriophagen. Quellen www.prüfung-ratgeber.de https://www.sofatutor.com/biologie/genetik-und- entwicklungsbiologie/gentechnik/was-bedeutet-dna-hybridisierung https://de.wikipedia.org/wiki/Hybridisierung_(Molekularbiologie https://www.biologie-seite.de/Biologie/Hybridisierung_(Molekularbiologie https://www.youtube.com/watch?v=gE4_xM6NLxg https://www.spektrum.de/lexikon/biologie-kompakt/dna- sequenzierung/3184 https://e-hausaufgaben.de/Referate/D5274-Referat-Biologie-Handout- Ausarbeitung-zum-Thema-DNA-Chips.php https://www.biologie-seite.de/Biologie/Thomas_Hunt_Morgan ► http://www.ngfn.de/index.php/kartierung_der_dna.html