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bei manchen Phagen ist es möglich, relativ große DNA-Fragmente in das Phagengenom einzubauen o die Infektion der Bakterien durch die Bakteriophagen gewährleistet eine spezifische und effektive Übertragung rekombinanter DANN c. Hybride Vektoren Neben den reinen Plasmid- und Phagenvektoren gibt es noch gemischte Klonierungsvektoren. o Phagemide bzw. Phasmide: ▪ enthält Teile des Genoms von Phagen und Plasmiden o Cosmide ▪sie erlauben den Einbau von relativ großen DNA-Fragmente EUKARYOTISCHE VEKTOREN a. Ti-Plasmid - geeignet bei Pflanzen b. Retroviraler Vektor - am häufigsten eingesetzte Vektoren für die Klonierung in Säugerzellen - WDH: O ss RNA o wird ins menschliche Genom integriert Genom eines Retrovirus: 5'LTR PSI P gag pol env 3'LTR P= Promotor - Viren müssen o Ausbau: replikationsinkompetent gemacht werden ■ gag-Gene (Capsidproteine) pol-Gene (Enzyme: RT, Integrase, Protease) ▪env-Gene (Hüllproteine) Regulatorische Sequenzen ■ Einbau: ▪ Promotor ▪ Fremdgen (Insert) ▪ Selektionsmarker (nachweis des erfolgreichen Einbaus) Genom eines retroviralen Vektors: 5 LTR PSI P Fremdgen P Sel.marker 3`LTR Vorteile - Besitzen hohe Transfektionseffizienz fast 100 / (Transfektion Einbringen genetischen Materials in eine eukaryotische Zelle) - Integrieren ihr Genom stabil in das Wirtsgenom = Nachteile - Integration erfolgt an zufälliger Stelle im Genom - oft aktive Gene oder Promotorregionen betroffen (kann zur Entartung führen!) - transduzieren nur sich teilende Zellen - Wichtigste Anwendungsgebiete: o Gentherapie o Markierung von Zellen z.B. zur Beobachtung von Zellteilungen c. YACs (Yeast artificial chromosoms) - künstliches Hefechromosom - Klonierungsvektor mit den wichtigsten Elementen des Hefechromosoms für u.a. Replikation - erlaubt Klonierung von langen DNA-Fragmenten Expressionsvektoren DEFINITION - spezielle Klonierungsvektoren für Expression fremder Gene und damit für Proteinherstellung - damit fremdes gen in Prokaryoten in hohen Mengen gebildet werden, sind 3 Signale besonders wichtig: 1. Promotor 2. Terminator 3. Ribosomenbindungsstelle PROMOTOR - Stelle an der die Transkription beginnen soll - Prokaryoten: Promotorsequenz: -35-Region und -10-Region (die sog. Pribnow-Box) ▪ wird vom -Faktor erkannt (-35 und -10 Region) Eukaryoten ▪ Promotorsequenz: TATA-Box ▪ Transkriptionsfaktoren helfen RNA-Polymerase den Promotor zu finden - je nach Basensequenz schwacher oder starker Promotor (Konsensussequenz) - Um die Expression des klonierten Gens genau steuern zu können gibt es: ▪ Induzierbare Promotoren: Anschalten der Produktion mit Zugabe eines bestimmten Stoffwechselproduktes (z. B. lac-Promotor) Vorteil für die Produktion von Genprodukten, die für die Zelle toxisch sind: Produktion wird erst gestartet, wenn genügend Zellen vorhanden sind ▪ reprimierbar: Abschalten der Produktion mit bestimmtem Stoffwechselprodukt (zB. trp- Promotor)