DNA Sequenzierung nach Sanger

Zitronensaft

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11/12/10

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DNA Sequenzierung nach Sanger > mithilfe von der Sanger Sequenzierung oder auch Kettenabbruchsynthese kann die Abfolge der einzelnen DNA nukleotide und dadurch die Reihenfolge der Basen bestimmen Grundprinzip > Mithilfe von Enzymen werden unterschiedlich lange DNA Abschnitte zu generieren, die sich jeweils um nur ein Basenpaar unterscheiden > Anschließend können sie ihrer Länge nach katalysiert werden worüber dann auf die Basenabfolge geschlossen werden kann Wozu? > Früherkennung von Erbkrankheiten > Aufklärung von Verwandschaftsbeziehungen > Namensgeber Frederick Sanger > klassisches VErfahren in der DNA Sequenzierung -> wird häufig durch leistungsfähigere modernere Verfahren abgelöst > Vorraussetzung ist dass kleiner Sequenzbereich des zu untersuchenden Abschnitts bekannt ist >An diesen Abschnitt künstlich hergestellter Primer binden -> Polymerase macht ihre Arbeit -> Polymerase Kettenreaktion Ablau 1. DENATURIERUNG Durch Hitzeeinwirkung (ca. 90°) Trennung der Wasserstoffbrücken -> zwei Einzelstränge 2. PRIMERHYBRIDISIERUNG > Primer lagert sich an den komplementären Abschnitt an dem Vorlagestrang an 3. HERSTELLUNG DER REAKTIONSANSÄTZE > 4 Parallele, grundsätzlich identische Reaktionsänsätze > DNA Einzelstrangabschnitte mit angelagerten Primern > DNA nukleotide mit den 4 Basen > Enzym Polymerase > zusätzlich jeder Ansatz Didesoxynukleotide (können nur an einer Seite mit einem weiteren nukleotid verbinden). Synthese zum erliegen —> deshalb auch Kettenabbruchmethode 4. POLYMERISATION -> bringen DNA > Aublauf der DNA Replikation bzw. Der Polymerase Kettenreaktion > Dies läuft bis zum Erreichen eines Didesoxynukleotid -> Synthese kommt zum erliegen (Kettenabbruch) zufällig > Schlussendlich erhält man nach einziger Zeit unterschiedlich lange DNA...

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Fragmente, die jeweils immer auf dem gleichen Didesoxynukleotid enden. Es kommt immer an der selben Base zum Kettenabbruch, aber an einer unterschiedlichen Stelle. 5.ZIEL > Alle theoretisch möglichen Sequenzfragmente herstellen 6. AUSWERTUNG > Mithilfe der Gelelektrophorese werden die DNA Fragmente nach der jeweiligen Länge aufgetrennt, sodass sie sich nur um ein Basenpaar unterscheiden > Durch Anlegen einer elektrischen Spannung wandern die kürzeren, somit leichteren Fragmente der negativ geladenen DNA schneller zum Plus Pol als die längeren schwereren DNA Bruchstücke > wenn man nun die jeweiligen Didesoxynukleotide abliest erhält man die Basenabfolge. —> entspricht der DNA Vorlage vom Anfang > heute werden die Didesoxynukleotide mit Fluoreszenzfarbstoffen gekoppelt, sodass nur noch ein REaktionsgefäß benötigt wird und durch Anregung mit einem Laser auf die Basen geschlossen werden kann

Biologie /