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PCR-Methode und Gelelektrophorese
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Chiara
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Kurze Zusammenfassung der Polymerasekettenreaktionsmethode und der Gelektrophorese
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3 5' 3' si Polymerase-Kettenreaktionen → geringste Mengen an DUA lassen sich in kürzester Zeit millionenfach identisch ver vielfältigen -> die PCR wird in einem sogenannten 1, Thermocycler" durchgeführt ein Heizblock der drei Temperatur stut in 2ykten bis zu 30 Mal durchläuft jeder drei Schritten ab DENATURIERUNG PCR-2yklus läuft immer in den gleichen > Die DNA Probe wird auf 95° Celsius erhitzt > bei dieser Temperatur werden die Wasserstoff- brückenbindungen zwischen den Nucleotider getrennt (Doppelstrang wird in Einzelstränge autgespalter) PCR-ZYULUS BEGIUNT VON VORNE Man benötigt: > die zu vervielfältigende DNA > Nucleotide (Adenin, Thymin, Cytosin, Guanin > eine hitzebeständige DNA-Polymerase Chierfür eignet Sich die Taq-Polymerase) welche die Synthese von DNA im Reaktionsansatz der PCR ermöglicht > zwei Primer die den zu untersuchenden Sequenzen- bereich begrenzen 5' 5' > Taq- Polymerase löst sich durch Erhöhung der Temperatur wieder ab > neue DNA- Doppelstränge trennen sich wieder voneinander 5' (Polymerase Chain Reaction) 3' 5' 5' T Primer HYBRIDISIERUNG > Die Temperatur wird wieder aut ca. 50 ° Celsius heruntergefahren (Probe abgeltni) > komplementare Nucleotidketter (Primer) lagern sich jeweils am 3- Ende der wiederholungs sequenzer der Einzelstrange an > Sie bilden die Primer Ansatzstellen für die DUA-Polymerase POLYMERISIERUNG 5 3¹ 3' > Die Probe wird erneut erhitzt und beträgt 72° Celsius > Mithilfe der Taq- Polymerase werden die komplementaren Nucleotide ausgehend von 31-Ende des Primers angelagert →vounüpfung kontinuirlicher Strang 5' die Temparatur H 5¹ 1. Schritt - DNA-Abschnitte werden durch Restriktionsenzyme in verschieden große Fragmente verschnitten · negativ geladene DNA-Fragmente (autgrund der Phosphat gruppe) werden in die Geltasche gefüllt - Gel wird in eine Elektrophorese hammer mit Pufferlösung gelegt, in der sich...
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die Elektroder befinder 2. Schritt die zwei Elektroder werden an den Strom angeschlossen, sodass eine elektrische Spannung entsteht - die negativ geladenen Molekule wandern in Richtung der positiv geladeren Anode je kurzer die Fragmente sind desto 3. Schritt -Geltaschen - Sobald das Ende des Gels ereicht ist, wird der Strom abgestellt -es bilden sich gleichlange Banden, wo sich jeweils gleichlange Molekule befinder - um die Banden sichtbar zu machen, werden sie durch besondere Färbetechniken (floreszierende Reagenzien) gefärbt Gelelektrophorese Probe Anwendung · kriminalistik Tätersuche Uaterschaftsnachweis - Humangeretik - Paläontologie Lebensmittel analytik machen 1 Ziel Molekule lassen sich voneinander tennen (meisters DNA, RNA oder Proteine) & in Bandermustern Sichtbar besser & schneller können sie sich durch das Gel bewegen vergleiche con zwei Proben (2b. Tater?) 2 Auswertung -es bilden sich Bander mit Fragmenten mit → besitzen gleiche Wanderungsgeschwindigkeit Massenstandards 3 - Banden werden durch Farbetechniken sichtbar ge- macht - resultierende Bander werden mit schon bekannter Banden verglichen lassen → Move kule, deren Masse → hann im Vergleich auf die unbekannte Fragmente Schließen gleicher werden zugleich mitlauter man kennt Masse Masse der ge-
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