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PCR - Polymerase Kettenreaktion
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Nele
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PCR - Polymerase Kettenreaktion -> allgemeine Infos, was benötigt man -> PCR Ablauf -> Denaturierung, Hybridisierung, Polymerisation-> Ziel -> Vergleich PCR mit DNA-Replikation
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Polymerase Kettenreaktion (PCR) > Mithilfe der Polymerase-Kettenreaktion (Polymerase chain reaction) ist es möglich, unbegrenzt viele Kopien eines vorliegenden DNA-Abschnittes herzustellen > die Ermittlung der Basensequenz von der DNA gehört zu den wichtigsten Zielen moderner Genforschung -> DNA-Abschnitte -> Gene 3 wwwwww -> ganze Genome > in der Medizin dienen diese Analysen der Diagnose von Krankheit und der Identifizierung von Krankheitserregern -> oder die Täterschaft verdächtiger Personen Festzustellen = genetischer Fingerabdruck Mithilfe der PCR ist es möglich, DNA-Sequenzen in kurzer Zeit millionenfach zu kopieren > jedoch werden bei der PCR keine kompletten DNA-Doppelstränge vervielfältigt, sondern nur zuvor festgelegte Teilabschnitte. PCR Ablauf PRANGANYAYAYILE ՈՈՈՈՈՈՈՈՈ ↓ THE Primer MÖÑÒMÒÒMÓMOMKÖR Taq-Polymerase ՈՈՈՈՈ JBA AY AYA YA H 869898941 Ort Auftrennen des DNA-Doppelstrangs Synthese der komplementären Stränge Primer Polymerase 3` Endprodukt Vergleich PCR mit DNA-Replikation Einzelsträngen aufgespalten) Molekül dissoziiert in Einzelstränge Denaturierung: > die DNA-Probe wird auf 95° Celsius erhitzt > Matrizen DNA wird ,,geschmolzen" > bei dieser Temperatur werden die Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den Nucleotiden getrennt (Doppelstrang wird in DNA Primer > werden künstlich gesetzt > sind länger: 20-25 Nucleotide > müssen nicht ersetzt werden Hybridisierung: > Abkühlung des Reaktionsgemisches auf ca. 50° Celsius > synthetische Oligonucleotide binden an die Einzelstränge der DNA -> Primer -> binden sich jeweils komplementär an das 3` Ende der DNA > Primer = Ausgangspunkt der Synthese neuer DNA-Stränge Man benötigt: Polymerisation: > Temperatur auf 70-75° Celsius -> hitzebeständige Taq-Polymerase -> besitzt Temperaturoptimum bei 72°C -> Enzym aus thermophilen Bakterium Thermus aquaticus, das in heißen Quellen lebt > vom 3` Ende der Primer synthetisiert Taq-Polymerase den komplementärstrang POR in...
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Vitro (künstlich außerhalb der Zelle; im Labor > 25-35 PCR-Zyklen, um eine für die Analyse ausreichende DNA-Menge zu gewinnen 2 durch die Denaturierung bei ca. 90° Verläuft an beiden Strängen kontinuierlich (Elongation) in 5`-> 3 Richtung - isolierte DNA - nucleotide Ziel: > mit der PCR lassen sich DNA-Abschnitte beliebig vervielfältigen, sodass auch geringste genetische Spuren ausreichen, um DNA nachzuweisen & ggf. Personen zuzuordnen (z.B bei Vaterschaftstest oder in Kriminalfällen) taq-Polymerase primer pufferlösung thermocycler Hitzebeständige Polymerase, z.B taq-Polymerase 2^20 2^30 identische DNA Doppelstränge –; ↓ -> bis zu 2^25 - 2^35 DNA-Fragmente Die Vervielfältigung des DNA-Fragmentes läuft exponentiell ab. Beschreiben kann dies die Formel: F(X)=2^x (X: Anzahl der Zyklen) DNA-Replikation in Vivo (in der Zelle) durch das Enzym Helicase Verläuft am Leitstrang kontinuierlich & am Folgestrang diskontinuierlich RNA Primer > werden durch die Primase gesetzt > sind kürzer: 5-10 Nucleotide > müssen durch DNA Nucleotide ersetzt werden DNA Polymerase 1 und DNA Polymerase 2 2 identisch verdoppelte DNA Doppelstränge
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