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Angewandte Genetik

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-Polymerase kettenreaktion (polymerase chain reaction)
ziel: künstliche Vervielfältigung der DNA
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PER-METHODE -Polymerase kettenreaktion (polymerase chain reaction) ziel: künstliche Vervielfältigung der DNA benötigt: • die zu vervielfältigende DNA vier DNA- Nucleotide (Adenin-Thymin und Cytosin-Guanin) zwei Primer mit definierter DNA-sequenz • Taq-Polymerase: spezielle DNA-Polymerase -> besonders hitzeresistent (85°) • Thermocycler 1 Denaturierung: • Erwärmung auf ca. 90° führt zu Trennung der DNA-Doppelnelix →> Wasserstoffbrückenbindungen lösen sich => zwei Einzelstränge Hybridisierung: • An die beiden Einzelstränge lagern sich bei ca. 60° zwei zuvor synthetisierte Primer am 3'Ende an → zum 3¹ Ende komplementär 2 (3 →> Wasserstoffbrückenbindungen zwischen Primer und DNA- Strang => Ansatzstelle für DNA-Polymerase Synthese/Polymerisation: • DNA Synthese: Taq-Polymerase verknüpft komplementäre Nucleotide (Reaktionsansatz) mit Einzelstrang-> neuer Strang in 5' nach 3' Richtung => zwei Doppelstränge • Zyklus beginnt von vorne →→ Polymerase löst sich durch Erwärmung Denaturierung (80°) weitere Zyklen Primer A Hybridisierung (60°) Synthese (700) Taq-Polymerase 5'-3' Primer B 5 GRUNDOPERATIONEN GENTECHNIK Restriktionsenzyme: • spalten DNA -Doppelstrang im inneren -> biochemische Scheren hochspezifisch: schneiden nur an bestimmten Stellen • Erkennungssequenz: spiegelbildlich →Basenabfolge des einen DNA-Stranges entspricht Sequenz des komplementären Stranges in umgekehrter Richtung (palindromische Enden) • versetztes Schneiden →> kurzes, herausragendes Stück Einzelstrang -DNA (sticky ends) Erkennungssequenz klebrige Enden Ligase: verknüpft sticky ends mit DNA: schwache Wasserstoffbrücken -> stabile Elektronenpaar bindungen Auftrennung der Fremd- DNA-> Restriktionsenzym entstehen sticky ends +Entnehmen eines Ab- schnitts der DNA Erkennungssequenz BAKTERIEM PLASMIDE • extrachromosomale DNA in Form von ringförmigen Molekülen (Prokaryoten) als Vektoren verwendet -> Transfer von Fremd-DNA in einen Organismus Xin5'-3% 2) es entsteht: Fremd-DNA Abschnitt X Spender-DNA Bakterienplasmid 3 5 Fremd-DNA wird in Plasmid eingesetzt (3) Auftrennen des Bakterien- plasmides: mit gleichem Re- striktionsenzym für gleiche sticky ends (4)...

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es entstent : aufgetrenntes Bakterienplasmid 6 Bestehen zwei Möglichkeiten Bakterienplasmid mit Fremd-DNA Bakterien plasmid ohne Fremd- DIVA →Transformation : Plasmid wird in Bakteriumzelle eingeschleust Drei Möglichkeiten: 9 (10) Bakterium mit Bakterium mit Bakterium Bakterien- Bakterien- plasmid plasmid + Fremd DNA keine Fremd- DNA Selektion: ohne Bakterien- plasmid Ziel: Bakterium mit Bakterienplasmid +Fremd DNA herausfiltern Selektion A: Bakterien ohne Plasmid sterben ab -> keine Tetracyclinresistenz Bakterien mit Plasmid + Fremd DNA und Bakterien mit Plasmid vermehren sich Überstempelung durch samtstempel ARG тура Nährboden mit Tetracyclin- Antibiotikum Nährboden mit Ampicillin- Antibiotikum Selektion B: Bakterien mit Plasmid ohne Fremd-DNA sterben ab →>keine Ampicillinresistenz Bakterien mit Plasmid +Fremd-DNA 6 ARG +TRG Transformation in die Bakterienzelle Тур в Selektion A Selektion B 12 13 (8) -TRG Тур с (11) Überstempelung (Samtstempel) - Sanger Funktion: Ermittlung der Basensequenz einer DNA-Probe durch -> Kettenabbruch methode Notwendig: DNA als Einzelstrang DNA-Polymerase ● ● ● and-SEQUEN ZIERWAG radioaktiv makierte Primer die vier Nucleotide (Adenin-Thymin und Cytasin-Guanin) vier Abruchnucleotide (dd A, dd T, dda, dd C) modifizierte Nucleotide nach denen keine weiteren Moleküle mehr binden können VORGANG: 1. verfielfältigte DNA (PCR) wird erhitzt → Doppelhelix -> 2 Einzelhelix 2. DNA + Primer+ Polymerase + Nucleotide werden auf vier Ansätze verteilt dda dd A dd T LITT ddc Gel-Elektrophorese с G A I N T -Leserichtung → MTUGUA Stin 3' ↑ AJUST UN M 3' jeder Ansatz enthält zusätzlich eine Sorte eines Abbruchnucleotides 3. radioaktive Primer setzen an 3' Ende des codogenen Stranges an-> DNA-Polymerase verknüpft Nucleotide mit DNA in 5'-> 3' Richtung (Codestrang) 4. DNA-Synthese bricht ab wenn Abbruchnucleotid ein- gebaut wird → geschieht nicht immer aufgrund von niedriger Konzentration es entstehen unterschiedlich lange DNA- Fragmente in den Ansätzen (je nach Zahl und Position der Abbruchnucleotide) 5. erneute Erhitzung: Doppelstrang in Einzelstrang →> ermittelte DNA-Fragmente liegen in 5¹->81 Richtung vor 6. DNA-Fragmente werden mittels Genelektrophorese getrennt zu analysierende Gel-Elektrophorese ermittelt komplementären Sequenz Strang GENETISCHER FINGERABBRUCK Funktion: Kriminalogie, Vaterschaftstest etc. Polymorphismus: Auftreten von individuellen Sequenzunterschieden • meistens in nicht codierenden Teilen der DNA nachteilige Mutationen werden eliminiert STR-Methode: short tandem repeats (STR) bestimmte Basensequenzen im nicht codierenden Teil wiederholen sich tandemartig hohe Mutationsrate → Anzahl der Wiederholungen ist individuell • Kombination von verschiedenen STR-Genarten für eindeutige Identifizierung vorgang: 1. DNA-Proben werden mithilfe der PCR verfielfältigt Basensequenz vor und hinter den STR's immer gleich -> Konstruieren von Primern die STR genau umfassen 2. Auftrennung der verfielfältigten STR's durch Gelelektrophorese Vaterschaftstest: STR werden vererbt →> Kind erhällt von Mutter ein Chromosom mit spezifischen Repeats (Bsp7) und vom Vater das homologe Chromosom mit Wiederholungen (Bsp. 9) überprüfung: 1. Locus mit Wiederholungssequenz wird bei Personen durch PCR verfielfältigt ->setzt an Primerbindungsstelle an 2. Gelelektrophorese: aufgrund unterschiedlicher Länge werden Banden erkennbar -> können Vater und Mutter zugeordnet werden Chromosom der Mutter DNA 看 AGG AGG AGG AGG AGG Mutter Kind DNA Vater Chromosom des Vaters AGG AGG STR-Analyse beruht auf Analyse mehrerer STR-Loci, wodurch sich das spezifische Muster eines Individuums erkennen lässt. ▼ übereinstimmungen aber niemals komplett gleich → Eltern haben diploiden Chromo- somensatz

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Vielen Dank, wirklich hilfreich für mich, da wir gerade genau das Thema in der Schule haben 😁

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