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DNA-Sequenzierung

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Primer 3'
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Polymerisierung 3
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zu analysierende Sequenz .
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DNA- St radioaktiv - markierter. 1 MOMM Primer 3' 5' 5 5' F -ddATP 1-dd CTP Polymerisierung 3 '8¹ zu analysierende Sequenz . Denaturierung 5" DNA- Sequenzierung 3' 5" Denaturierung der DNA Hybridisierung des Primers 5' --ddGTP neusynthetie-.. siebter Strang Leserichtung '3' ♡ TUTTUU TUA VOOL 3 • Die Basenabfolge einer DNA kann mit verschiedenen Sequenzierungsmethoden bestimmt werden 5' -dd TTP ITUATOUT 5'. C -A. А A A C G T Autoradiogamm zu analysierende Sequenz- ABI •Kettenabbruchmethode: basiert auf Neusynthese von DNA und verläuft in den gleichen Phasen wie PCR: Denaturierung Hybrisisierung Polymerisierung. ein Reaktionssatz besteht immer aus allen vier Desoxynukleosid-Triphosphaten, der Taq-Polymerase sowie den zu sequenzierenden, denaturierten DNA- Einzelstrang Abschnitt → anders als bei der PCR ist nur ein Primer nötig, der radioaktiv markiert ist zusätzlich enthält jeder Reaktionssatz jeweils ein Abbruch-Nukleosid- Trisphosphat (ddNTP) in geringer Menge hat eine Hydroxylgruppe zu wenig, deshalb kann bei der Synthese des Komplementärstranges das nächste Nukleosid nicht angeheftet werden in dem Reaktionssatz, der als Abbruch-Nukleosid-Triphosphat das ddATP enthält, kommt es also immer zu einem Abbruch der Kettenverlängerung, wenn das Abbruch-Nukleosid mit der Base Adenin zufällig statt des normalen Adinin-. Nukleosids eingebaut wird 4 es entsteht eine Fragment-Familie von Komplementärsträngen aller möglichen Längen, die immer mit Adinin enden es laufen parallel vier Reaktionsätze ab man erhält vier Fragment-Familien 4 diese FF werden jeweils denaturiert und parallel durch die Gel-Elektrophorese der Größe nach getrennt. 4 die negativ geladenen DNA-Fragmente wandern wandern im elektrischen Feld zum Pluspol ↳ Fragmente werden durch Audioradiographie sichtbar gemacht LD 4 alle Fragmente enthalten den radioaktiven Primer, weshalb die Schwarzfärbungen auf dem Film entstehen 46 die komplementäre Basensequenz kann nun auf dem...

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Vielen Dank, wirklich hilfreich für mich, da wir gerade genau das Thema in der Schule haben 😁

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