Gentechnik

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sind sozusagen angeschaltet. Avy-Mäuse Versuch Ablauf: Trächtigen weiblichen Mäusen (FO; ,,Großmütter") mit braunem Fell wurde ab der Mitte der Tragzeit entweder Nahrung mit viel, normal oder wenig Folsäure, Methionin und Zink verabreicht Auswertung: Die Fellfarbe hängt mit der Methylierung der DNA zusammen. Je mehr Methylgruppen an der DNA gebunden sind, desto brauner ist das Fell der Mäuse. Erhalten die Mäuse Nahrung mit viel Folsäure, Methionin und Zink, haben sie die Möglichkeit viele Methylgruppen zu bilden und an die DNA zu binden. Erhalten die Mäuse Nahrung mit wenig Folsäure, Methionin und Zink, haben sie keine Möglichkeit Methylgruppen zu bilden und an die DNA zu binden. Warum haben dann aber die Kinder (F1-Generation), ungeachtet der Ernährung, braunes Fell? Dies liegt daran, dass die Methylierung der DNA der Nachkommen im Mutterleib schon zu Beginn der Tragzeit festgelegt wird. So hatte nur die Fellfarbe/Methylierung der DNA der Großmutter (FO-Generation) einen Einfluss auf die Fellfarbe der Kinder (F1). Anders sieht es bei den Enkelkindern (F2-Generation aus). Durch die Ernährung der Großmutter wurde die DNA der Keimzellen der Kinder (F1) unterschiedlich epigenetisch geprägt. Fall 1: Großmütter erhalten viel Folsäure, Methionin und Zink Die DNA in den Keimzellen der F1-Generation, kann aufgrund der Ernährung methyliert werden. Diese führt dazu, dass die Enkelkinder (F2) eine starke Methylierung der DNA aufweisen und somit überdurchschnittlich häufig eine braune Fellfarbe erhalten. Fall2: Großmütter erhalten wenig Folsäure, Methionin und Zink Die DNA in den Keimzellen der F1-Generation, kann aufgrund der Ernährung nicht methyliert werden. Diese führt dazu, dass die Enkelkinder (F2) keine oder nur eine schwache Methylierung der DNA aufweisen und somit überdurchschnittlich häufig eine gelbe Fellfarbe erhalten. C Mikrobiologie Methyl donor supplementation E8.5-E15.5 No supplementation Ein Nährmedium, auch als Kulturmedium bezeichnet, dient zur Kultivierung von Mikroorganismen, Zellen, Geweben oder kleinen Pflanzen Künstlicher Gentransfer - Grundoperationen der Gentechnik oder "Wie gelangt das Gen X in den gewünschten Organismus?" 2021 о Isolation eines Gens X herausschneiden des Genx mit Restriktions- Gen X enzymen, wobei "klebrige Enden entstehen Ⓒ Selektion der trans- formierten Zellen https://www.youtube.com/watch?v=t0-OxFATQm8 "/ go aufschneiden des Plasmids mit dem gleichen Restriktionsenzyn 3 Transformation Künstlicher Gentransfer Seite 1 HT|| Gen x Rekombiniertes Plasmid Rekombination der DNA Gen x wird eingebaut Ligase + Gen x + Plasmid Ligase 2 Möglichkeiten Gen x wird nicht eingebant 28 E. coli mit Bakterien - Chromosom (A) Restriktionsenzyme • Restriktionsendonuklease (griech. endon: innen, innerhalb): ein Enzym, welches DNA von Innen abbaut • Restriktionsenzyme schützen Bakterien, in dem sie eingedrungene Fremd-DNA abbauen Restriktionsenzyme schneiden an einer bestimmten 2. B. bei Eco R1 GAATTC ... G C TTAAG ... GTTAA • Restriktions enzyme schneiden immer zwischen Zucker & Phosphor von zwei bestimmten Basen. Bei Eco R1 zwischen G & A (B) Übertragen von DNA zur DNA - Übertragung nutzt man sog. Vektoren • Plasmide (meist künstlich synthetisiert) Viren • Direkte Genübertragung Erkennungssequenz. Das sind palindromische Basensequenzen AATTC... G.. oder "Gen-Taxis". Diese können sein: Blau-Weiß-Selektion -> Verfahren, mit dem man feststellen kann, ob das Einschleusen eines Gens in ein Bakterium funktioniert hat oder nicht. INSULIN-GEN (FREMDGE) AMPKILLIN RESISTENZ-GEN PLASMID NAHRMEDIUM MIT AMPICILLIN (ANTIBIOTIKUM) & X-GAL (ZUCKER) KEIN PLASHID AUFGENOMMEN STERBEU AB B-GALACTOSIPASE NICHT REKOMBINANTES PLASMID AUFGENOMMEN BLAU RESTRIKTIONS- ΕΝΖΥΜ REKOMBINANTES PLASMID AUFGENOMMEN WEIß Gen für Ampicillinresistenz .::. Die sind resistent gegen: Ampicillin > Fremdgen Mögliche Kombinationen beim Einbau des Fremdgens + Tetracyclinh Ampicillin Bakterienzellen 0/0 UNVERANDERTES REKOMBINANTES PLASM ID PLASMID + 4 Einbau Mischen von Plasmiden und Bakterienzellen DNA eingebaut DNA nicht eingebaut kein Plasmid in der Zelle Zucht der Bakterien auf tetracyclin- und ampicillinhaltigen Platten 3. Isolation des gewünschten Bakteriums: Um die entsprechenden Bakterien zu isolieren, wählt man die Bakterien aus, die im Tetracyclin- Nährboden nicht, dafür aber im Ampicillin-Nährboden gewachsen sind. Hierfür nimmt man eine Kolonie (einen Punkt auf der Petrischale) mit einer sterilen Impföse vom Nährboden herunter und gibt es in ein Flüssigmedium. Dieses Flüssigmedium enthält alle Nährstoffe, die das Bakterium benötigt. Das Flüssigmedium und die Bakterien befinden sich meist in einem Erlenmeyerkolben, welches dann in einen Brutschrank gestellt wird. Der Brutschrank wird auf die Wohlfühltemperatur des Bakteriums gestellt. So hat das Bakterium die besten Bedingungen um sich zu vermehren. 1. Fremd-DNA mit klebrigen Enden wird an der Stelle A in das Gen für Tetracyclinresistenz eingefügt keins Bakterien, die diesen Plasmidring auf- nehmen sind resistent gegen Ampicillin. und Tetracyclin. D. h. kommen sie mit diesen Antibiotika in kontakt, Tetracyclinresistenz überleben se. Gen für E. Coli 4. Mögliche Transformationen Durch den Einbau der fremd-DNA wird das Gen für die Tetracyclinresistenz unterbrochen.. funktionsloses toy peptid. Bakterien, die das Plasmid mit Fremdgen aufnehmen haben nur eine Resistent für shpicillin. 2. Tetracyclin Ampicillin SNährboden mit Ampicillin und XGal 5 Bio - 1 Fritsche AB von Hr. Theobald Abgabe bis: 13.04.2021 19.00 Uhr RFLP: "Restriction fragment length polymorphism", d.h. die DNA verschiedener Menschen wird aufgrund von differierender Lage gleicher Erkennungssequenzen von Restriktionsenzymen in Teilstücke zerschnitten, die sich sowohl in der Zahl als auch in der Länge unterscheiden. (8) 2021-04-13.Bio.Lösung.RFLP&STRgenFingerabdruck Die Personen A - C sind verdächtig, an einem Einbruch beteiligt zu sein. Ihre DNA wird mit einer Probe verglichen, die man am Tatort gefunden hat. Das eingesetzte Enzym erkennt die Sequenz TTAA. Es schneidet diese zwischen T und A. (5) [email protected] Abgabe per moodle Verdächtiger A: CGGTCATTAAG C G CT CTT TA ACGGGTTAA ATAG C C G C T TA A G C C G G C TAC GCCAGTAATTCGCGAGAAATTGCCCAATTTATCGGCGAATTCG GCCGATG (8) (11) Der genetische Fingerabdruck - RFLP 1. Erläutere den Begriff RFLP und erkläre das Zustandekommen der Unterschiede! 2. Markiere die Schnittstellen des Enzyms in der DNA der drei Verdächtigen und ermittle die Längen der Fragmente! 3. Zeichne die Bruchstücke - nach ihrer Länge sortiert - in das Gel ein und werte das Ergebnis aus! (11) (12) (14) Verdächtiger B: CGCTTA ATATGCGTATTA A CAGATTA ACGTAGCTCTT CCG GAATTAA CGT GCGAATTATACGCATAATTGTCTAATTGCATCGAGAAGGCCTTAATTGCA (12) (8) Buch S. 202 (14) (20) (5) Verdächtiger C: GAT CC GAAT GCGT TA A C G C G C G TATATTAAGCACAGG GT GT C T TA A C G C G CTAGGCTTACGCAATTGCGCGCATATAATTCGTGT CC CACAGAATTGCGC (16) (6) Auswertung: A ist der Täter, denn nur sein DNA-Muster stimmt mit dem des Tatortes vollständig überein. (Das von B weist noch gewisse Ähnlichkeiten auf, das von C zeigt keinerlei Übereinstimmung.) Basen- länge 20 15 10 Tatort- spur A B 1 STRS: "Short tandem repeats" sind vielfache Wiederholungen kurzer Basenfolgen. Diese liegen an definierten Stellen auf den Chromosomen, den sogenannten Mikrosatelliten, ihre Wiederholungszahlen schwanken jedoch erheblich. Auch auf den mütterlichen und den väterlichen Allelen sind die Zahlen meist verschieden. Eine Frau möchte Sicherheit erlangen, welcher von zwei Männern der Vater ihres Kindes ist: Mikrosatellit Anzahl der Repeats Mikrosatellit Anzahl der Repeats Mikrosatellit Anzahl der Repeats Mikrosatellit Anzahl der Repeats ⒸGIDA 2015 1 8 10 1 10 12 1 10 14 1 12 14 2 16 19 2 16 18 Der genetische Fingerabdruck - STRs 1. Erläutere den Begriff STRs und erkläre das Zustandekommen der Unterschiede! 2. Markiere bei dem Kind die mütterlichen Allele (übereinstimmende Repeats) in grün! 3. Kennzeichne bei den möglichen Vätern die mit dem Kind übereinstimmenden Repeats (Allele) in rot und werte aus! 4. Erkläre an dem unten dargestellten Beispiel, dass die Auswertung umso sicherer wird, je mehr Mikrosatelliten untersucht werden! 2 12 18 2 18 23 3 21 23 3 15 21 3 7 16 3 14 15 Mutter 4 10 13 Kind 4 6 10 Mann 1 4 6 8 Mann 2 4 6 8 5 14 17 5 15 17 5 16 22 5 14 15 6 12 13 6 13 15 17 7 16 17 6 15 17 7 9 16 6 15 17 |7 12 25 875 8 28 28 7 9 12 8 24 28 15 Parola 8 24 28 Auswertung: Mann 2 ist der Vater, da er bei jedem Mikrosatelliten das nicht mütterliche Allel des Kinds aufweist. Die Auswertung wird umso sicherer, je mehr Mikrosatelliten untersucht werden, weil: Bei der Untersuchung nur weniger Genorte zufällige Übereinstimmungen auftreten können. Mann 1 zeigt z. B. in drei Genorten Übereinstimmungen mit dem Kind; würden nur diese untersucht, käme man zu dem falschen Ergebnis, dass er der Vater sein könne. 2 EINGRENZEN EINES GENORTS AM BEISPIEL DES BRUSTKREBS-GENS Die Chromosomen von gesunden und an Brustkrebs erkrankten Frauen wird mit dem gleichen Restriktions- enzym geschnitten erkrankte Frauen haben auf dem langen Arm des Chromosom 17 ein RFLP- Fragment gleicher Länge (20000 kB) (Gekoppelte Vererbung von diesem RFLP und dem Brustkrebs - Gen lässt darauf schli liegt) das Brustkrebs-Gen in der Nähe der RFLP Mikrosatelliten in diesem RFLP-Fragment werden gesucht Genort lässt sich auf 600kB eingrenzen lenthält 60 Gene) Hybridisierung der 600 kB DNA mit mRNA von Brustkrebszellen Eingrenzen des Brustkrebs- Gen auf einen Bereich von 100 kB en, dass DNA mRNA von Brust- krebszellen CDNA (COMPLEMENTARY/COPY) • wird mithilfe des Enzyms reverse Transkriptase hergestellt und ist komplementär zu einem bestimmten Abschnitt einer mRNA (=1=1 Transkription reverse Gen 1 DNA Transkriptase G A T A CONA Aufgabe 1 Gensequenzierung: Die Strang-Abbruchmethode liefert die Basensequenz eines DNA-Abschnitts. Genkartierung: Mittels Genmarkern wird die Lage (und die Funktion) des Gens ermittelt. Aufgabe 2 Aus der Aminosäuresequenz lässt sich über die Codesonne eine Nucleotidsequenz ermitteln. Bei Eukaryoten entspricht dieser der Reifen mRNA, das heißt, es handelt sich um eine Nucleotidsequenz, aus der bereits die Introns herausgeschnitten wurden. Dadurch ist ihre Bindefähigkeit bei der Hybridisierung eingeschränkt. Bei Bakterien gibt es keine Introns, weshalb die ermittelte Sequenz genau der ursprünglichen DNA-Sequenz entspricht. Anwendung der Gentechnik bei Pflanzen Im Vergleich zu Versuch 2 wurde in Versuch 3 eine Gentechnische Veränderung vorgenommen. Bei der gentechnisch veränderten Tomate wird ein künstliches Antisense-Gen eingesetzt und somit entsteht die Antisense-mRNA. Die mRNA ist komplementär zur natürlichen mRNA. Diese wird nun mit der natürlichen mRNA, hybridisiert. Dieses Antisense-Gen verhindert die Herstellung des Polygalakturonase Enzyms. Die Translation kann nicht stattfinden. Somit ist kein Enzym mehr vorhanden das für das Matschen der Tomate verantwortlich ist. Sie bleibt also länger haltbar. gentechnisch veränderte Tomate -Polygalakturonase-Gen WWWDCOM. DNA normale Tomate 2 Natürlicher Vorgang ohne gentechnische Veränderungen Funktion Antisense-Gen künstliches Antisense-Gen YAWADA DNA Polygalakturonase-Gen DNA → WINDOW natürliche m-RNA XU natürliche m-RNA Anti-Matsch-Tomate Antisense- m-RNA U G 3 Vorgang in einer gentechnisch veränderten Tomate (Flavr-Savr) Polygalakturonase Hybridisierung Doppelstrang kann night von Ribotomen abgelesen werden natürlich verrottende Tomate keine →→ Polygalakturonase haltbare Tomate Um nun zu verhindern, dass die mRNA die Information für ein bestimmtes Eiweiß (Protein) in den Ribosomen absetzt, wird bei der Antisense-Strategie ein komplementäres - gegensinniges (antisense) - Gen in die Pflanzenzelle eingebracht. Dessen mRNA lagert sich als passendes Gegenstück an die mRNA des Proteins an und blockiert sie auf diese Weise. Genübertragung bei Viren 1 Erläutern Sie, warum Rekombination bei Viren nur bei gleichzeitiger Infektion eines Wirtes mit zwei verschiedenen Viren auftritt. Viren haben keinen eigenen Stoffwechsel, deshalb sind sie zu ihrer Vermehrung auf die Infektion einer leben- den Zelle angewiesen. Deshalb können Viren auch untereinander kein geneti- sches Material austauschen, wenn sie nicht gleichzeitig ein und dieselbe lebende Wirtszelle parasitieren. Genübertragung zwischen Bakterien durch Viren 1 Vergleichen Sie allgemeine und spezielle Transduktion. Bei der allgemeinen Transduktion werden beliebige Wirtsgene nach dem Zufallsprinzip mit Hilfe von viru- lenten Phagen übertragen. Bei der speziellen Transduktion werden durch tempe- rente Phagen nur solche Wirtsgene transferiert, die nahe der Integrationsstelle des Prophagen im Bakterienchro- mosom liegen. Beiden Transduktionen ist gemeinsam, dass Bakterien- zellen über einen Phagen genetisches Material austau- schen. Der wesentliche Unterschied liegt darin, dass bei der allgemeinen Transduktion virulente Phagen wie T2 ver- wendet werden und bei der speziellen Transduktion temperente Phagen wie Lambda. Daraus ergibt sich als weitere Konsequenz, dass bei den virulenten Phagen zufällig ein beliebiges Stück der Wirts-DNA ausgetauscht wird, während bei den tem- perenten Phagen nur DNA-Stücke des Wirts in Frage kommen, die sich in direkter Nachbarschaft des Pro- phagen befinden. In der neuen Wirtszelle müssen die DNA-Stücke, die durch die Phagen eingebracht wurden, jeweils durch crossing-over-Vorgänge in das Ringchromosom der neuen Wirtszelle integriert werden. Hülle eines virulenten Phagen (T2) Transduktion Lt 3 0 0 5 neue Wirtszelle Phagen-DNA AB*L*M* L M+2 M L M L Bakterien- DNA Phagen- proteine Hülle eines temperenten Phagen (Lambda) 10,00% 0 0 crossing-over Bakterien-DNA Prophagen-DNA rekombinante Bakterien. 112.1 Transduktion. A allgemeine; B spezielle Bt-Mais vs Maiszünsler Das Bakterium Agrobacterium tumefaciens (lat. für tumormachendes Ackerbakterium) kann bei Verletzungen von Pflanzenzellen Gene seines Ti-Plasmids (Ti-tumorinduzierend) in das Genom der Pflanzenzelle integrieren und sie veranlassen Opine zu bilden. Opine sind Stoffe, die das Bakterium für seine Ernährung nutzen kann, die aber für die Pflanze nutzlos sind. Gleichzeitig veranlassen die vom Ti-Plasmid übertragenen Gene die Bildung von Pflanzenhormonen, die die Teilungsaktivität der Pflanzenzellen stark erhöhen. Die sich bildenden Zellwucherungen bieten Lebensraum für die Bakterien. Agrobacterium tumefaciens Bakterienchromosom Gene zur Nutzung der Opine. Ti-Plasmid T-Region Kallus Gene zur Integration ins pflanzliche Genom und zur Bildung von Opinen sowie zur Aktivierung der Pflanzenhormone. Signalstoffe der Pflanze aktivieren die Gene für die Infektion. T-Komplex Bakterielles Selektionsgen - Gewünschtes Gen Zugabe der Bakterien mit Ti-Plasmid Eine vegetative Vermehrung ist bei Pflanzen meist leicht möglich. So kann ein abgeschnittener Zweig in die Erde gesteckt werden, der dann zu einer neuen Pflanze heran- wächst. Dazu müssen in den Zellen an der Schnittstelle die Gene aktiviert werden, die für die Bildung neuer Wurzeln erforderlich sind. Im Labor lassen sich oft sogar aus einzel- nen Zellen wieder ganze Pflanzen regenerieren, wenn sie in spezielle Nährmedien gegeben werden. Viele Pflanzen sind also totipotent, in der Folge sind alle sich daraus entwickeln- den Pflanzen genetisch identisch. Nährmedium mit Antibiotikum Für einen Gentranstransfer wird ein gezähmtes Ti-Plasmid benötigt, da die zu transformierenden Zellen keine Tumoren bilden sollen. Das Ti-Plasmid soll das gewünschte Gen in die Pflan- zenzelle übertragen. Bakterieller Promotor Opine T-DNA In-vitro Sprosse Pflanzliches Selektionsgen (z.B. Antibiotika-Resistenz) Pflanzlicher Promotor Ti-Plasmid T Pflanzenzelle Pflanzenhormone zur Erhöhung der Teilungsrate Pflanze in Erde Das Antibiotikum bewirkt, dass nur die Zellen wachsen können, die das Plasmid erfolgreich integriert haben. Warum ist Vielzahl der Bt-Toxine bei der Anwendung in der Landwirtschaft von Vorteil? Da die Toxine spezifisch auf verschiedene Insektenarten wirken, können auch spezifisch Schädlinge abgewehrt werden, ohne anderen Insekten zu schaden. Genetische Transformation einer Pflanze Zur Herstellung von Bt-Mais sind verschiedene Schritte nötig: 2 O Bakterien- -chromosom -Plasmid Bakterienzelle mit Plasmid Gene-Pharming Restriktion und Ligation der DNA 4 Schnittstelle für das Restriktionsenzym in der übertragbaren DNA des Plasmids Spender-DNA COLE HIHI rekombinantes Plasmid Restriktionsenzyme schneiden die DNA an spezifischer Stelle mit glattem oder wie hier mit versetztem Schnitt. (neu kombiniertes) Einführung in die Pflanzenzelle Das gewünschte Gen (hier für ein Insektizid co- dierend) wird aus der DNA einer Spenderart her- ausgeschnitten, um es in ein Plasmid einzusetzen. Ligase rekombinante DNA Regeneration einer Pflanze mit neuem Merkmal Ligasen kleben 3'- und 5-Enden von DNA-Stücken zusammen. transgene Pflanze (hier Mais mit selbst produzier- tem Insektizid) Der Einbau von Fremd-DNA in eukaryoti- sche Zellen ist schwieriger als bei Bakte- rien, aber heute ebenfalls Routine. Transgen: Ein Konstrukt aus einem Fremdgen und einem geeignetem Promoter. Ein Promotor ist ein DNA-Abschnitt, der die RNA-Polymerase bindet. Nur wenn sich vor dem Fremdgen ein geeigneter Promoter befindet, kann die Transkription des Gens erfolgen. Transgenes Tier: In die DNA eines transgenen Tieres wurde ein Gen einer anderen Art erfolgreich eingebaut, sodass dieses auch abgelesen und das zugehörige Protein gebildet wird. Dadurch erhält das transgene Tier neue Eigenschaften, wie z. B. die Produktion eines bestimmten Medikaments. Das Transgen wird in eine befruchtete Eizelle eingebracht. Weshalb wird nicht die Euterzellen des Versuchstieres gentechnisch verändert? Wird das Transgen in die Zygote eingebracht, besteht die Chance, dass alle Zellen des heranwachsenden Tieres die Fremd-DNA enthalten. Würde man die Fremd-DNA dagegen in die Euterzelle einbringen, müsste man zahlreiche Zellen verändern, da Euterzellen als differenzierte Zellen nicht mehr Teilungsfähig sind. Da das Fragment von Schaf A eine kürzere Laufstrecke zurückgelegt hat, enthält es mehr Basenpaare, d.h. die Transgene sind in die DNA eingebaut worden. Das Tier ist homozygot. Schaf B ist heterozygot bezüglich des Einbaus der Gene und bei Schaf C ist der Einbau der Transgene nicht gelungen, da das DNA- Fragment schneller durch das Gel wandert, somit kürzer ist und daher die Fremdgene nicht enthält. Schaf A 2 Gel-Elektrophorese Der Nachwuchs wird ausgetragen Das gewünschte Gen mit Promotor wird in eine befruchtete Eizelle eingebracht Į Zygoten (befruchtete Eizelle) werden in Leihmütter überführt und ausgetragen Schaf B Selektion des transgenen Nachwuchses mittels PCR Der Zellkern der Euterzelle des transgenen Nachwuchses wird in die entfernte Eizelle eines erwachsenen Tieres eingebracht Übertragung der Eizelle in eine Leihmutter Austragen des Nachwuchses J Der weibliche Nachwuchs produziert Milch mit dem Proteinase-Inhibitor Schaf C ↓ Der Proteinase-Inhibitor kann aus der Milch extrahiert werden und dann als Medikament genutzt werden 0 Lactoriobulin Proteinase Promotor Crispr: Schere Cas 9: Sucher Crispr / Cas 9 Genschere Inhibitor-Gen Fremdgen wird injiziert Übertragung auf Leihmutter Eizelle Klonierung 1 Gentechnische Herstellung des Proteinase-Inhibitors Erstinfektion 30x bakterielle DNA Befruchtung xx befruchtete Eizelle (Zygote) Cas9-Gen Transkription Translation Übertragung auf Leihmutter 1 Nach der Zerstörung des Viren-Genoms fügen Bakterien einen kleinen Ausschnitt der Fremd-DNA in das eigene Erbgut als Spacer" ein. Auf diese Weise entsteht ein neuer ,,Spacer", der bei einem wiederholten Angriff der Viren als Vorlage dient, als eine Art ,,Gedächtnis". 2 Ein Cas 9-Protein (Cas 9-Gen wird transkribiert und translatiert) wird hergestellt. Der Spacer wird transkribiert sodass die CRISPR-RNA entsteht. Daraufhin verbinden sich Cas 9 Protein und CRISPR-RNA. Euterzelle 3 Bei erneutem Eindringen des gleichen Virus, erkennt das Cas 9-Protein die fremden DNA-Sequenzen. Die CRISPR- RNA ist komplementär zu einem Abschnitt der Viren-DNA, somit kann die Viren-DNA zerschnitten werden, um sie unschädlich zu machen. Endonuclease zerschneidet doppelsträngige RNA bzw. DNA Soooooooooooo Repeat Repeat Fragment des viralen eingebaut Repeat Spacer Spacer en Materials wird ielle Genom Transkription Ausbildung von Sekundärstrukturen CRISPR-RNA Selektion Cas9 Extraktion und Reinigung ** Milch mit Proteinase-Inhibitor 1 CRISPR/Cas-System zur Immunabwehr bei Bakterien (stark vereinfacht) transgener Klon Zweitinfektion 200x xxxxxxxx Cas9-Endonuclease --> Mit dem CRISPR/Cas-System lassen sich im Bereich der Gentechnik z. B. Gene in die DNA von Organismen einfügen, stilllegen oder verändern. Anwendung von Crispr/Cas 9 Mehltauresistenter Weizen Warum hat es bislang nicht geklappt? Das mlo-Gen ist im Genom von Weizen sechsmal vorhanden. Da bereits ein intaktes mlo-Gen ausreicht, um mlo- Proteine zu bilden, müssen für eine Resistenz gegenüber dem Pilz alle sechs Gene mutiert sein. Das ist bisher mit beiden Verfahren nicht gelungen. Genfähren/Vektoren: Um Gene in Pflanzen zu verändern, werden Hilfsmittel bzw. Organismen benötigt, die in der Lage sind Gene in die Pflanzenzelle einzubauen. Das ist in diesem Fall das Agrobakterium. Reportergene: Reportergene werden benötigt um aus einer Vielzahl von Zellen, diejenigen herauszufinden, die das gewünschte Gen aufweisen. Auf dem Nährmedium mit dem Antibiotikum wachsen nur die Zellen, die das Plasmid des Agrobakteriums eingebaut haben. Aufgaben des CRISPR / Cas- Komplexes • Cas-Enzym erzeugt Doppelstrangbrüche in den mlo-Genen • werden fehlerhaft repariert -> mlo-Gen kann nicht mehr repariert werden ist funktionsuntüchtig Vergleich Bt-Mais mit mehltauresistenten Weizen durch CRISPR-CAS-Komplex Bt-Mais enthält Gene, die von anderen Organismen stammen (Gene des Agrobakteriums für die Übertragung der Gene, das Bt-Gen von Bacillus thuringiensis sowie Reportergene). Diese Gene wurden an zufälligen Stellen des Genoms eingebaut. Der mehltauresistente Weizen enthält letztlich keine fremden Gene, da die eingebauten Gene wieder herausgekreuzt werden. In dem gentechnisch verändertem Weizen ist ein normalerweise sechsfach vorhandenes Gens an allen sechs Genorten mutiert. Das führt zum Verlust von dessen Funktionsfähigkeit. Pilz (Mehltau) siedelt zwischen den Pflanzenzellen und zapft diese an, um an Nährstoffe zu kommen. Das macht er mit einer Art, Schlauch", die er in die Zelle einführt. Um in die Pflanenzelle eindringen zu können, benötigt der Erreger ein bestimmtes Protein auf der Oberfläche der Zelle, welches er für seine Zwecke manipuliert: das MLO- Protein. Ein Grund für die Resistenz gegen Mehltau: Eine zufällige Mutation in dem Gen, das für die Bildung des MLO- Proteins verantwortlich ist. Durch diese Mutation wird die Information zur Bildung des MLO-Proteins nicht mehr richtig abgelesen und dem Pilz so die Möglichkeit für ein Eindringen in die Pflanzenzelle entzogen. Weizen: Resistent durch dreifache Mutation Weizen durch eine Mutation des MLO-Gens mit einer Resistenz gegen Mehltau auszustatten, ist allerdings schwierig. Denn Weizen hat ein sehr komplexes Genom (Erbgut), das etwa sechsmal so groß ist wie das des Menschen. Weizen ist hexaploid, d.h. er besitzt drei Genome und alle Gene liegen deshalb dreifach vor. Um zu erreichen, dass das MLO-Protein nicht mehr gebildet wird, müsste in allen drei MLO-Genen gleichzeitig eine Mutation erzeugt werden. Das ist mit klassischer Züchtung nicht oder nur über sehr lange Zeiträume möglich. Deshalb gibt es bis heute keine Weizensorten mit MLO-Resistenz. Mit den neuen Methoden des Genome Editings, insbesondere der ,,Gen-Schere" CRISPR/Cas stehen nun neue Werkzeuge zur Verfügung, mit denen zielgenau Mutationen im Genom durchgeführt werden können. Das eröffnet die Chance, auch bei Weizen eine wirksame, dauerhafte Resistenz gegen Mehltau zu erreichen. Denn mit der Gen- Schere ist es möglich, alle drei MLO-Gene gleichzeitig auszuschalten. Voraussetzung dabei ist, dass man die Stelle im Genom des Weizens, die eine Mutation erhalten soll, genau kennt. Das CRISPR-Werkzeug besteht dann im Wesentlichen aus einem Stück RNA (Guide-RNA), das die entsprechende Stelle im Genom finden soll und deshalb genau zur Zielsequenz passen muss, und einem daran gekoppelten Protein (Cas9), das den DNA-Strang an der gewünschten Stelle schneidet. Der DNA-Strang wird dann vom zelleigenen Reparaturmechanismus wieder zusammengefügt, dabei entstehen aber Fehler und das Gen kann nicht mehr richtig abgelesen werden. Das CRISPR-Werkzeug wird derzeit noch mit klassischen gentechnischen Verfahren - in der Regel mit Hilfe von Agrobakterien - in die Pflanzenzelle eingebracht. Wenn es an gewünschter Stelle eine Mutation ausgelöst hat, wird es nicht mehr gebraucht und muss dann wieder entfernt werden. Das gelingt mit den Regeln der Vererbung: Wenn die editierten Weizenpflanzen nach der Selbstbefruchtung Körner ausbilden, enthält ein Viertel dieser Nachkommen zwar die gewünschte Mutation, aber das Werkzeug ist nicht mehr vorhanden. Art Merkmale/Charakteristika Vor- und Nachteile Ungeschlechtlich Geschlechtliche und ungeschlechtliche Fortpflanzung Geschlechtlich • keine Bildung von Keimzellen keine Befruchtung -> Kernteilungen laufen ausschließlich als Mitosen ab -> Nachkommen entstehen nur aus einem Elternteil (durch Mitose) • genetische Neukombination nicht möglich -> alle Nachkommen sind genetisch identisch -> Nachkommen bilden einen Klon des Elternteils Vorteile: - hohe Anzahl an Nachkommen in kurzer Zeit - geringer Aufwand da keine Partnersuche notwendig ist Nachteile: - keine genetische Rekombination • spezielle Keimzellen werden gebildet große unbewegliche Keimzellen sind weibliche Keimzellen -> nennt man Eizellen • männliche sind kleiner und beweglich • Keimzellen sind haploid (enthalten nur einen einfachen Satz an Erbinfos) bei ihrer Bildung laufen Meiosen ab • bei der Befruchtung verschmelzen Spermium und Zellkerne der Eizelle zur Zygote -> neue Kombination väterlicher & mütterlicher Erbinfos entsteht -> Nachkommen sind also untereinander verschieden Vorteile: - Anpassungen durch genetische Rekombination möglich (Evolution) - höhere Variabilität (höhere Überlebenschance) Nachteile: - aufwendige Partnersuche, gerade bei niedriger Anzahl an Individuen in einem Habitat (Lebensraum) Bedeutung der Sexualität Vorteil der einelterlichen Fortpflanzung - mehr Nachkommen entstehen - einfacher (da man nur ein Tier brauch) Beispiele pflanzlich tierisch Tierisch Pflanzlich • Ausläufer der Erdbeere • Bildung kleiner Pflänzchen beim Brutblatt • Süßwasserpolyp • undifferenzierte Zellen wachsen zu einem neuen Tier heran, welches sich vom Elternpolyp löst • Begattung bei Säugern, Vögel, Insekten, Schnecken durch spezielle Geschlechtsapparate -> innere Besamung . Fische, Frösche lassen ihre Keimzellen ins Wasser ab -> äußere Besamung • Blütenpflanzen bei dene der Pollen (männliche Keimzelle) auf die Narbe übertragen wird, über den Pollenschlauch gelangt das Spermium zum Fruchtknoten Vorteil der geschlechtlichen Fortpflanzung: - Anpassungen durch genetische Rekombination möglich -> Evolution - Erhöhung der Variabilität (Beispiel Mäuse: Bei den Nachkommen kommen Merkmalskombinationen vor, die die Eltern nicht aufweisen) -> höhere Überlebenschance der Mäusepopulation