Gentechnik und Reproduktionsbiologie

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Reverse Transkriplase: stellt aus isoliertem mRNA strong wieder entsprechenden DUA-Strang her. Diese neuen DNA- Molekule bezeichnet man als copy-DNA oder CDNA.. cDNA ist Genabschnitt ohne Introns (d.h. Eukaryoten müssen Prozessierung durchlaufen haben) Um fremde DNA in eine. Wirtszelle zu überführen, werden. Vektoren verwendet. Diese dienen als Transportmittel, um neue DNA- Stücke zu überführen. Häufig werden Plasmide aus Bakterienzellen als Vektoren verwendet. 5- Schritte bis zur rekombinanten DUA 1. Isolierung der DUA.. Der DNA- Abschnitt, der in einen anderen Organismus oder eine andere Zelle eingebaut werden soll, wird von der restlichen Zelle. Isoliert und mithilfe von Restriktionsentymen. in kleinere Fragmente Zerschnitten → sticky ends' 2. Isolierung des Vektors: um den gewünschten DUA- Abschnitt überführen zu können, muss ein geeigneter Vektor isoliert werden. Mithilfe der Restriktionsenzyme wird der Vektor aufgeschnitten.. Vom Eukaryoten Gen zur CDNA Reverse Transkriptase. Virales Enzym, mit dem (lysogene) R.NA-Viren ihr Erbgut in eine DNA um schreiben, damit ihr Erbgut Wirts-DNA integriert werden kann. 1 Ampicilin Resistenz-Gen Eukaryoten-Gen in DNA GIDA 2015 → CDNA. E. coll chne B-Galactosidase-Gen unverändertes Plasmid Plasmid keine Resistenz gegen Ampicillin, keine Kolonien 0 Selektion wwwwwwwwwwww Reverse Transkriptase mit RNA und Einzelstrang-DNA-Kopie wird durch. PCR vermehrt. B-Galactosidase Gen wwwww.pe prä-mRNA mit Exons und Introns Selekton transgener Bakterien: Gentechnische Herstellung von Insulin und blau-weiß Verfahren Insulin-Gen kann nicht direkt in die Bakterien-DNA integriert werden, da sie Introns enthält und. Bakterien nicht speißen können. Deswegen wird m-RNA des Proinsulins mithilfe der Reverse transkriptase in C-DNA umgewandelt und mittels. PCR vervielfälligt.. Restriction Ligation -O Restriktions- b Enzym (nur am Gen) Insulin-Gen <-gleiches Restriktions- enzym →→sticky ends rekombinantes Plasmid 6 Bakterien kultur www. HMINEN Polymerase verdoppelt zum DNA-Doppelstrang CDNA ohne Introns von zB Menschlicher DNA Resistenz gegen Ampicillin, blaue Kolonien gewünschtes Insulingen wurde nicht eingebaut B-Galactoseidase Spaltet X-Gal in Galactose und blauen Farbstoff Insulin wurde eingesetal Ligase Verbindet die Strange Transformation Plasmid wird in und Ausplattieren Bakterium aufgenommen auf Selektionsmedium (X-Gal*, Amp) 3 Kulturmedium mit Ampillicin+ Zucker X-Gal gespleißte mRNA ohne introns Ampicillin-Resistonz, +Insulin-Gen, weiße Kolonien wwwwwwwwwwwwwwwww denn ß-Galactoseidase-Gen wurde zerstört durch Insulingen →keine blau Förbung da keine Spaltung von von x-Gal Zucker in die 1. Herstellung von CDUA aus der mRNA der Insulin bildenden Zellen des llenschen 2. Restrition: öffnen des. Plasmids durch Restriktionsenzyme (am Gen). Insulingen gleiches Restriktionsenzym 3. Ligation: Anheftung der Sticky ends von Insulingen und Plasmid = rekombinantes Plasmid 4. Transformation Plasmid wird in Bakterium aufgenommen. 5. Selektion: Prüfen ob Plasmid in. Bakterium aufgenommen wurde und ob es die gewünschte Information enthält (Ampicillin Resistenz. + Insulingen) Die Stempeltechnik. 1. Restriktionsenzyme schneiden Gen aus Genom (2.B des Menschen) heraus 2. Plasmide aus Bakterien werden, isoliert. Einbau von zwei Genen, die Resistenz gegen Antibiotika bewirken (Ampicillin u. Tetracyclin. 3 öffnung des Plasmids durch Restriktionsenzym im Bereich des Gens, das de Resistenz gegen Tetracyclin bewirkt 4. Die meisten. Plasmidringe schließen sich wieder, ohne. das Fremdgen eingebaut wurde 5. Zugabe des Fremdgens; einige wenige. Plasmide bauen. das Fremdgen ein 6. Ein schleusen der Plasmide in die Wirtszelle (Bakterienzelle), nur wenige Bakterienzellen. nehmen ein Plasmid auf 7. Vermehrung der. Bakterien in einer Nährlösung, die Ampicillin enthällt. Es vermehren sich nur die Bakterien, die ein Plasmid aufgenommen haben Gen für Ampicillin- resistenz (AMP) DNA O Gen für Tetracyclin- resistenz (TET) 8. Beimpfen eines Nährbodens (Petrischale I), der Ampillicin enthällt, mit. Bakterien, die ein Plasmid enthalten (Bakterien, die in der Ampillicin- haltigen Lösung vermehrt wurden). erkennbares Muster von Bakterienkulturen entsteht Bakterien, die kein Plasmid aufgenom- men haben Nährlösung Ampicillin AMP AMP TET os Bakterien, die Plasmid ohne Fremdgen aufge nommen haben Nährboden mit Ampicillin I AMP 10. Diagnose der Bakterienkulturen in Schale I, die das Fremdgen enthalten und Sie werden vermehrt und bilden nun den erwünschten genetisch veränderten Bakterienstamm eingesetztes Gen TET 03 Bakterien, die Plasmid mit Fremdgen aufge nommen haben Nährboden mit Tetracyclin T in Schale II. nich vermehrt 9. Übertragung der Kulturen mit einem Samtstempel auf einen. Nährboden, der Tetracyclin (und Ampicillin) enthällt (Schale II).. Muster, der Bakterien kultur, in. Schale. I wird auf Schale II kopiert.. TET Folge Bakterien, die ein Plasmid aufgenommen haben, das das Fremdgen enthält, vermehren sich nicht. Er kennbar wird das daran, dass an den entsprechenden Stellen der Schale I keine Bakterienkulturen entstehen. (Kultur 4 & 8) Ursache: Das Resistenzgen gegen Tetracyclin ist durch den Einbau des Fremdgens unwirksam geworden. wurden (4&8) 3. Hybridisierung: Der ausgewählte DUA-Abschnitt 4. Transformation: Die neue kombination aus DUA- Abschnitt und. Vektor wird in. Zellmembran durchlässig gemacht wird. → transgener. Organismus. wird dann durch Ligase mit dem Vektor verknüpft Vom Plasmid aum. Vektor 5. Selektion mit hoher Wahrscheinlichkeit haben nicht alle Empfangerzellen die rekombinante DNA aufgenommen. Deswegen müssen die. Zellen identifiziert und isoliert werden, welche die gewünschten Genkombinationen besitzen. Dazu werden die Zellen mithilfe eines Selektivverfahrens, bei dem die anderen Zellen absterben, identifiziert und vermehrt. (DNA-Kolonierung). Diese Vermehrung. erfolgt häufig mit Antibiotika. Auf dem. Vektor befinden sich nämlich auch ein Resistenzen Markergene gegen bestimmte. Substanzen Gibt man nun Antibiotika Zu den Wirtszellen, so werden nur diejenigen, überleben, die eine Resistenz dagegen besitzen, also den Vektor erfolgreich aufgenommen haben. Plasmid Extrachomosomaler DUA-Ring, der sich unabhängig replizieren kann und Vektor, Gentaxi'.d.h. Gentechnisch. Verändertes Plasmid. Benennung: 1. Isolation das gewünschte Plasmid wird aus Bakterien 2. Restriktion:,. aufschneiden" des. Plasmidrings mit Erzeugung von "sticky ends 3. Enbau hinzufügen verschiedener DNA- Abschnitte (mit, den gleichen sticky ends).: Markergene, MCS, Fremdgen 4. Verknüpfen: durch Ligase werden die Lücken in den DNA- Strängen. geschlossen ORI Anheftungsstelle für Helicase und Polymerase ·Marker gene Identifizierung des Vektors & 3 Resistenza UCS: DUA- Abschnitt mit Erkennungssequenzen verschiedener Restriktionsenzyme, Zum Einbau des Fremdgens einen Empfänger Organismus überfünst, indem die entnommen 4 Baktenum Vorteilhafte Eigenschaften, verkeit. Fremdgen oder gewünschtes Gen Vorlage zur Synthese des Wunschprodukts Bedeutung der Restriktionsenzyme: Enzyme, die bestimmte. Basensequenzen der. DNA erkennen, sich an diese anlagern und die DNA glatt oder mit überhang zerschneiden, Sie kommen in Bakterien voc und haben die Funktion, eindringende Virus-DNA. zu zerstören, bevor diese das Kommando über den Stoffwechsel des Wirls aber nimmt Die überhängenden Einzelstrangenden bezeichnet man auch als sticky ends, weil sich an diesen DNA-Stücke mit komplementären Einzelstrangenden anlagem (hybridisieren) können. Dadurch können. Fremdgene gezielt in eine vorhandene DNA eingebaut werden. Gentransfer - Methoden mit geeigneten Vektoren Mikroinjektion mit sehr Viren feiner Kanalle können de Zelmembran und die Kernhülle durchstochen werden und Fremd-DNA kann direkt in den kern injiziert werden Das Fremdgen wird in ein wirtsspezifisches Virus eingebaut. Vrus infiziert die Zele und Schleust dabei die Fremd-DUA ein. Verwendet man Retroviren, wird das Fremdgen in das Genom eingebaut... Agrobacterium: Durch Pflanzenstoffe veranlasst schleust das Agrobakterium de T-DUA des Ti-Plasmids über Zellverletzung in die Zelle. Dabe regulieren Gene auf der T-DNA autonom ihre Integration in das Genom der Zelle Elektroporation durch elektrische Entladungen werden vorübergehend Löcher in die Zellmembran erzeugt, durch die Fremd- DNA aus dem umgegebenen Medium eindringen kann. F ગામ F વાસ <-DNA-Probe wird mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert Partikelpistole Kleine Goldpartikel werden mit Fremd-DNA beschichtet und damit wird die Zelle beschossen. Dabei gelangen beladene Partikel auch in den Zellkern. Mit der Partikel pistole können auch Pflanzenzellwände durchdrungen werden.. FBB PPE Screening mithilfe von radioaktiven. Gensonden Kennt man die Basensequenz von Genen, die erblich bedingte Krankheiten zugrunde liegen, kann man diese durch komplementäre Gensonden aufspüren (Gen lässt sich auch bei Personen erffassen, bei denen die Krankheit noch nicht ausgebrochen ist. Eine Gensonde ist eine komplementare Sequenz (abschnitt) zu einem gesuchten Gen Chip mit einsträngiger DNA DNA-Untersuchung mit einem DNA-Chip Vorgehen 1 CDNA der Test DNA wird mit einem Fluoreszens Farbstoff markiert (Markergen) und mit. Gensonde zusammengebracht. zu untersuchende DNA an komplementäre DUA-Sequenzen (Gensonden) anlagern. 2. So kann sich die 3 Fluoreszenz-Signale zeigen an, wo Hybridisierung. Stattgefunden hat. Sie werden mit Scannern, und Computer ausgewertet. A R C G Mikroinjektion A PE C G A Hybridisierung Liposomen રીત T Agrobacterium Laser G m Partikelpistole T( CCD Kamera A Viren C Elektro- ) Т porahon Nachweis der Hybridisierung durch Anregung mit Laserlicht Gentherapie-ex/in-vivo - Verfahren Allgemeines Prinzip der Vorgehensweisen: > einbau eines intakten Gens: wenn nur ? Hemmung schädlicher Gene: bei. Infektionskrankheiten, die auf der dauerhaften. Integration viraler Gene beruhen, wie AIDS. durch gezeltes Ausschalten dieser schädlichen Gene soll die Virusvermehrung unterbrochen werden. ex-vivo-Verfahren > Deaktivieren des Gens auserhalb des Körpers >. Es werden vorübergehend Zellen (2.B Knochen- markzellen, Blutzellen oder Hautsellen) entnommen.. > Sie werden im Labor genetisch behandelt, in Zellkultur vermehrt und Patient verabreicht. • Vorteil: vor Rückführung der genetisch veränderten Zellen kann überpfrüft werden, ob sie erfolgreich verändert wurden. ex vivo •Nachteil: Manche Zellen lassen sich nicht so. einfach entnehmen (Himzellen...) isoliertes Gen AVAYA ein einziges Gen mutiert ist, wird ein intaktes. Allel des mutierten Gens in die betroffene Zelle eingebracht A Entnahme von Zellen Einschleusung des Gens in die Zellen der Kultur der in der Kultur Auswahl der erfolgreich behandelten Zellen Übertragung veränderter Zellen in den Patienten "Gen, wird in einen geeigneten Vektor eingebaut > durch injektion wird es direkt in den Körper des Patienten > Ziel: Vektor soll dort, die ezelle eindringen und deren Genom verändern, • Vorteil Zellen, die nicht einfach aus dem Körper zu entnehmen sind, können verändert werden • Nachteil: Nicht sicher ob das Verfahren erfolgreich war isoliertes Gen AVAVA in-vivo-Verfahren in vivo www Einpacken des intakten Gens in Viren oder in Liposomen Einschleusung des Gens in die Körperzellen spezieller Gewebe (Nieren, Leber etc.) Obertragung der Viren bzw. Liposomen in den Patienten (1) Dringt ein Virus in ein Bakterium ein, integriert die Bakterienzelle ein kurzes Stück der viralen DNA in einen Spacer des CRISPR- Abschnitts. Die CRISPR-DNA ist also eine Art Viren-Archiv mit Informationen über verschiedene Viren, die die Bakterienzelle (oder ihre Vorgängerzellen) bereits befallen haben. (1) Abkürzungen Cas: Virus CRISPR: clustered regularly interspaced short palindromic repeats proteins CRISPR-associated Bakterium Exaxaxaxaxand Spepea Repeat Repeat CRISPR-DNA ("Viren-Archiv") bakterielle DNA Spa xaxaxa virale DNA xxxx xxxx unschädlich gemachte virale DNA Falls das Bakterium überlebt, baut es einen Teil der viralen DNA ins eigene Genom ein Der Doppelstrangbruch wird vom zelleigenen Reparatursystem schnell aber meist fehlerhaft, repariert. Das Gen ist damit inaktiviert. Repeat Die Leit-RNA findet die komplementäre Stelle in der Ziel-DNA und Cas erzeugt einen Doppelstrangbruch. (2) xxxxXx neu einzubauendes DNA-Fragment TESSER Erneuter Virus- Befall (3) XR Transkription und Zurechtschneiden der RNA I Leit-RNA Cas9 virale DNA Bildung des CRISPR/Cas9- Komplexes Bindung an virale DNA (über komplementäre Basenpaarung) CRISPR in der Gentechnik Das Bakterielle CRISPR / Cas- System gleicht einer programmierbaren Genschere → funktioniert auch bei Eukaryoten →DUA- Basensequenzen lassen sich treffsicher ansteuern und an den gewünschten Stellen schneiden. →DUA- Reparatur gelingt, nur. fehlerhaft →→Gen wurde somit geziehlt zerstört/verandert → Gentherapie Bel der Forscher mit CRISPR/Cas- -System Mutahonen reparieren (2) Bei erneutem Virus-Befall wird der CRISPR/Cas9-Abwehr- mechanismus aktiviert: Die CRISPR-DNA wird zu RNA transkri- biert und geschnitten. Es entstehen verschiedene Arten Leit- RNA, die jeweils Information aus dem Bakteriengenom (schwarzer Teil) und einem Virus (farbiger Teil) enthalten. Eine Leit-RNA kann an das Protein Cas9 (CRISPR-assoziiertes Pro- tein, eine Nuklease) binden, welches ebenfalls vom Bakterium hergestellt wird und im Cytoplasma vorliegt. Es entsteht ein CRISPR/Cas9-Komplex. Vorgehen: Man muss eine tur Bel-DUA-Sequenz passende Leit-RNA. herstellen relativ leicht im Labor Leit-RNA and Cas9-Protein die Zielzelle eingebracht (in-vivo: Virus- Vektoren oder Liposomen, ev-vivo: Elektroporation, mit. Plasmid) und setzen Sich dort zum CRISPR/Cas9- Komplex zusammen. (3) Der CRISPR/Cas9-Komplex hat das Ziel die Virus-DNA zu erkennen, zu zerschneiden und damit unschädlich zu machen. Da ein Teil der Leit-RNA (rot) komplementär zur Virus-DNA ist, kann der Komplex über komplementäre Basenpaarung an die entsprechende Stelle in der Virus-DNA binden. Dadurch wird die Nuklease-Domäne des Cas9-Proteins aktiviert und das Protein erzeugt in der Virus-DNA einen Doppelstrang- bruch. Fazit: Je nachdem, welche Leit-RNA gebunden ist, erkennt und schneidet der CRISPR/Cas9-Komplex ganz unterschiedliche Virus-DNA-Sequenzen. Die Leit-RNA ist also eine Art aus- tauschbares Lenksystem, das die Schere" Cas9 zur jeweils gewünschten Ziel-DNA-Sequenz führt. Nachdem die Leit-RNA, den komplex zur gewünschten Stelle im Belzelligenom geführt in t, erzeugt das Cas 9- Protein einen Doppelstrangbruch in der DUA. Wie auch bei den herkömmlichen. Genscheren. führt der Zelleigene Reperaturmechanismus dazu, dass eine auf diese Weise geschnittenes. Gen deaktiviert wird oder ein zusätzlich beigefügtes Fremd-DNA-Stück in den Schnitt eingeführt wird. Cas g werden in Veränderte Cas-Proteine er zeugen Einzelstrangbrüche. XX COMO COMOMMOD-Ziel-ONA Der zerschnittenen Ziel-DNA wird ein DNA-Fragment hin zugefügt und durch die überstehenden Enden passgenau eingebaut. So kann z.B. eine Mutation repariert werden. -Leit-RNA Somahsche Gentherapie > Intaktes Erbmaterial gelangt nur. in Körperzellen > können an falsche Position gelangen und andere Gene beeinflussen > Risiken sind unkalkulierbar •Anwendung gesetzlich stark geregelt CRISPR als Abwehrsystem gegen. Viren a: Bakterien-DNA, die kurze, wiederholte DUA- Sequenzen (Repeats) anhäufen. Oft Palindrome vorwärts und rückwärts gleich lautend (wie, ABBA"). b Die Stücke dazwischen (Spacer). ind DNA-Fragmente von Viren Diese CRISPR-DUA ist Teil eines lernfähigen Abwehr systems der Bakterien C: Die CRISPR-DUA wird abschnittsweise transkribiert→→ CRISPR-RNA (cr RUA): bestehen aus einer vom Repeat gebildeten Schleife und der überstehenden. Spacersequenz. d: Bakterien exprimieren Cas-Proteine → mehrere Enzymfunktionen eine Helicase - Aktivität, um DNA- Doppelstränge lokal zu trennen. und zwei verschiedene, DNA-Scheren", um DNA-Einzelstränge bzw. RUA-DNA- Hybrid stränge zu zerschneiden. Sie binden die Repeat-RNA, wodurch ein CRISPR /Cas- Komplex entsteht, mit der Spacer-RNA zwischen den DNA-Scheren. So kann sie nun für den komplex als Leit- RUA dienen Palindrome Repeats (R) und virale Spacer (S) wechseln sich in der CRISPR-DNA ab. e: In der Zelle vorhandene DUA. drillt Cas lokal in Einzelstrange auf und die Leit-RNA versucht dann, komplementar an einen davon zu binden. Klappt dies, was nur bei der passenden Virus-DNA der Fall ist, dann werden beide DNA-Stränge von den Scheren durchgeschnitten → DNA-Zerstört. ✓ Keimbahntherapie > können in. Keimzellen eingefügt werden > in Deutschl aus Ethischen Aspekten verboten. ↳ fehlerhafte genehische Veränderungen können entstehen und. vererbt werden auf folgende Generation Bakterien haben ein Gedächnis für früheren Virenbefall und spezifisches Abwehrsystem gegen erneute Infektion durch das gleiche Virus Adaptive Immunabwehr der Wirbeltiere Die Prä-crRNA wird in einzelne crRNAS aufgeteilt. Spacer-RNA Repeat-RNA crRNAs Cas Bakterium -Virus DNA- Scheren gegen xxxxxxxxxvirale DNA RSRSRSRSRSR Transkription Viren. Die Spacer-RNA kann jetzt als Leit-RNA dienen. CRISPR/Cas-Komplex CRISPR/Cas-System ist ein Abwehrsystem von Bakterien gegen Viren. Die Spacer sind DNA-Fragmente verschiedener Viren, denen das Bakterium schon begegnet ist. CRISPR-DNA-Abschnitt im Bakterien-Chromosom Prä-crRNA virale DNA Zur Leit-RNA passende virale DNA wird bei einer neuen In- fektion erkannt und zerstört. BioK2 Bor 1) Nicht-integrative Ansätze Therapeutisch wirkende Gene werden Mukoviszidose durch Adeno-Viren in die Zielzellen beför- dert, aber nicht ins Genom integriert. Adenovirus Spray mit gentechnisch veränderten Adenoviren Doppelstrangbruch durch Genschere DNA-Reparatur xXxxxxxX Deletion Einbau eines nicht mutierten Allels mutiertes Gen 2000 2000 Vermehrung mutiertes Gen Mukoviszidose-Pasent 2) Retrovirus als Genfähren Therapeutisch wirkende Gene werden Hämophilie In- Zufällige Integration der durch Retroviren stabil ins Genom von Ziel-tegration des in- Virus-DNA → Gefahr zellen integriert. Häufig werden Stammzel- takten Gerinnungs- von Krebs oder anderen len behandelt. in Defekten!! faktor-Gens Blutstammzellen intaktes Gen Gentherapien im Überblick Gentechnik 3a) Gen-Editierung durch zielgenaue Genscheren Genscheren (Enzyme) schneiden DNA ziel- ZFN bei Hämophi- genau. Bei Reparatur der Schnitte wird Gen lie (in Maus- und deaktiviert (Deletion/Insertion) oder zuge- Zellkultur erfolg- gebene Fremd-DNA eingefügt. reich) xxxxxxxxx von DNA XXX XXXXXX Einfügen neuer Sequenzen ombinanter Anwendungsbeispiel (bisher nur Forschungsansätze!) Virus-Erbgut inches im Knochenmark (ex-vivo- Verfahren) → sehr breite Anwendungsmöglichkeit, auch außerhalb von Speziallabors. 3b) Genschere CRISPR-Cas Genschere wird durch eine guide-RNA ans HIV-Infektion Ziel gelenkt. Diese lässt sich deutlich einfa- cher, schneller und kostengünstiger verän- dern. u.v.m. Datum: keine Integration des therapeutischen Gens ins Zellgenom baldi- ger Abbau / keine Wei- tergabe bei Zellteilung. → häufige Wiederho- lung der Behandlung →Gefahr von heftiger Immunreaktion ... Probleme / Nachteile Extrem teuer und zeit- aufwändig in Herstel- lung, weil künstliches Protein... Genschere (eigent- lich Rekombinase) schneidet HIV aus Mäusen und Zell- Nur in Speziallabors kulturen aus möglich. Für jede neue Anwen- dung muss Genschere komplett neu entwickelt werden. www Bisher in manchen An- sätzen ungenau (off- target-Schnitte), *** Reproduktionsbiologie Praimplantationsdiagnostik (PID). Mit der PID können in vitro (im Glas- künstliche Befruchtung) befruchtete Eizellen vor dem Einbringen in die Gebärmutter auf genetische Eigenschaften hin untersucht werden. (spezielle Erbkrankheiten, Chromosomendefekte, Mutationen). u.a. Trisomie 21., lukoviszidose. Bei der in-vitro Fertilisation werden Eizellen aus dem Eierstock der Frau entnommen und außerhalb des Körpers mit aufbereitetem. Sperma befruchtet. Einige Tage später wird dieser mehrzellige Keim in die Gebärmutter übertragen. Die Übertragung der Keime in die Gebärmutter erfolgt im 4-zell, 8-Zell- oder Blastocysten - Stadium. Nur bei wenigen Keimen kommt es zum Ausschlüpfen aus ihrer Hülle und zur Einnistung in die Gebärmutter Geprüftes Erbgut Präimplantationsdiagnostik (PID): Ein Embryo wird nach einer künstlichen Befruchtung vor der Einpflanzung in die Gebärmutter auf krankhaft verändertes Erbgut (Erbkrankheiten) untersucht. (6a) Gesund Durch Hormonbehandlung reifen mehrere Eier heran. Aus dem Zellkern wird das Erbgut (DNA) isoliert. Dem Embryo wird eine Zelle entnommen Der Embryo wird zur Einpflanzung freigegeben. Befruchtung im Reagenzglas Bisher in Deutschland verboten, Ethikrat empfiehlt begrenzte Zulassung. (5) Die zu prüfenden DNA- Abschnitte werden herausgeschnitten, vervielfältigt und auf Erbkrankheiten untersucht. FELIPE FERIHE 6b Krank Es wird krankhaft verändertes Erbgut festgestellt. Der Embryo wird nicht eingepflanzt. → Selektion von Embryonen nach genetischen Anomalien, · Geschlecht.... Rechtssituation in Deutschland > nur dann zulässig, wenn eine hohe Wahrscheinlichkeit für eine schwerwiegende erblich bedingte Erkrankung vorliegt oder mit einer Fehl-oder Totgeburt zu rechnen ist. (Embryonenschutzgesetz.) Krinker. > befürchten, dass auf paare mit Kinderwunsch ein gesellschaftlicher Druck zur Verhinderung der Geburt. behinderter Kinde entstehen könnte. > Schutz des Embryos". > Eingriff in die Natur (Mensch spielt Gott) > Disskriminierung von behinderten Kindern Befürworter. > Jeder hat das recht auf Wissen > hohe Kosten für Pflege und medizinische Vorsorgung. worden vermieden werden. >. Paare können sich je nach Ergebniss besser auf die Situation vorbereiten. Chorea Huntington > Symptome treten zwischen dem > in einigen Fallen auch im Jugendalter (juvenile Form) > Zerstörung der Nervenzellen > Ursache lutation des Huntington-Gens auf Chromosom fahrt 30. und So. Lebensjahr auf. (adulle Form) ? Veränderung (Mutation) besteht darin, dass das Triplett CAG häufiger als 35-mal hintereinander Aminosäure Glutamin viele male hintereinander in das Protein eingebaut →Tertiar struktur des Proteins ist. Chromosom 4 Huntington- Gen Das Gen codiert für das Huntington-Protein, das zum Absterben von Nervenzellen Molekulare Diagnostik Durch Gentest mittels PCR lässt sich chorea Huntington diagnostizieren. → Erb material der. Testperson wird in PCR-Reaktion vervielfältigt. länge des PCR-Produkts hängt von der Anzahl der CAG- Wiederholungen ab. ->> stark verändert→→ Eiweißklumpen entstehen die sich im Vervengewebe ablagern. 2 Gentest für die Chorea-Huntington-Veranlagung Negatives Testergebnis: weniger als 35 CAG-Wiederholungen Unklares Testergebnis: 36 bis 39 CAG-Wieder- holungen wiederholt wird. Dadurch wird die polare Positives Testergebnis: mehr als 40 CAG-Wiederholungen CAG 48 CAG 18 Marker Vater Mutter Kind1 Kind 2 Kind 3 Kind 4 Krank Krank Krank 3 PCR-Analyse einer Familie mit Chorec Huntington Gewinnung embryonaler Stammzellen Befruchtung Beginn der Zellteilung Bis zum-Zellen-Stadium: noch nicht ausdifferenzierte, totipotente Zellen 1 Gewinnung embryonaler Stammzellen aus künstlich befruchteten Eizellen 2 Gewinnung embryonaler Stammzellen aus den Keimzellen abgetriebener Foeten 3 Körperzelle Kerntransfer: Eine Eizelle, deren Zellkern entfernt wurde, wird mit dem Zellkern einer Körperzelle verschmolzen. Die entkernte Eizelle kann von einem Menschen oder auch von einem Tier stammen. klonen. A Schaf A, dessen Erbgut geklont werden soll werden Körperzellen entnommen, die man durch Nährstoffentzug shungerna lässt. Pluripotente Zellen aus der inneren Zellmasse der Blastozyste werden entnommen und kultiviert OB Feine Stromimpulse regen die entstehende Zelle zu Teilungen an Die so entkernte Eizelle von B wird durch eine Stromimpulse (oder andere Auslöser) mit dem Kern einer Körperzelle von A verschmolzen Das entstehende Gebilde kann wieder totipotent werden Schat 8 werden durch Punktion reite unbefruchtete Eizellen entnommen, deren Kern mittels Mikropipette ab gesaugt wird, wodurch das Erbgut entfernt ist. Der wachsende Embryo wird in die Gebärmutter eines Leihmutterschafs C eingesetzt. C bringt den zeitlich versetzten Zwilling (Klon A) von A zur Welt. Embryo im Blasto- zystenstadium Eizelle Geklontes Lamm A (genetisch fest identische Kopie von A) Abb. 14: Das Prinzip des Klonens, wie es beim Schaf Dolly raktiziert wurde 2.Tag *Nur fast identisch, well es einige Gene für Atmungspigmente gibt, die aus dem Zellsalt von B stammen rekonstruierter Embryo Der so entkernten Eizelle wird der Kern der Körperzele ceingeimpfta. Die neue Zelle, die fast ausschließlich das Erbgut des Spenders enthält, erlangt wieder Totipotent, und die Embryonalentwicklung setzt ein. Im 6-Zell-Stadium kann der Embryo auf Erbschäden hin untersucht werden. 3.Tag 4.Tag 5.-11.Woche Ab dem 4./5. Tag: Spezialisierung der pluripotenten Zellen z. B. in Vorläuferzellen von Organen Dem Spender, dessen Erbgut geklont werden soll, wird der Kern einer Körperzelle entnommen. Der Maulbeerkeim wird in die Gebärmutter einer Leihmutter eingesetzt, die das Kind austrägt. Kultivierung embryonaler Stammzellen Differenzierung in verschiedene Zellen und Gewebe Von einer Spenderin werden reife unbefruchtete Elzellen entnommen, deren Kerne mittels Mikropipette abgesaugt werden, wodurch das Erbgut ent- fernt wird. Das geklonte Kind ist ein genetisch fast identischer Zwilling des Spenders. Nicht ganz identisch, weil es einige Gene für wichtige Atmungspigmente gibt, die aus dem Zellsaft der Eizelle stammen Abb. 15: So könnte das reproduktive Klonen bein Menschen eines Tages praktiziert werden → Verboten Bel: Zwilling des Spenders Blutzellen Nervenzellen Knochenzellen Herzmuskelzellen Leberzellen Inselzellen Hautzellen Dem Patienten wind eine Körperzelle entnommen. Mit einer Mikropipette wird Ihr Zellkern isollert. Der Patient erhält eine körper- eigene und also immunverträgliche Zellspende, um seine kranken Zellen, Organe oder Gewebe zu ersetzen bzw. zu regenerieren. leas achsene E Patient. Die Eizelle einer Spenderin wird entkernt. Die Stammzellen entwickeln sich im Labor zu verschiedenen spezialisierten Zelltypen (Blutzellen etc.). Hautzellen, Nervenzellen Der so entkernten Eizelle wird der Kern der Körperzelle reingeimpfta Die neue Zelle, die fast ausschließ lich das Erbgut des Spenders ent- hat, erlangt wieder Totipotenz, und die Embryonalentwicklung setzt ein WWE RA Aus der inneren Zellmasse der Blastocyst werden pluripotente embryonale Stamm zellen entnommen. Die Blastocyste wird dabel in ihrer Entwicklung gestoppt. Die Eizellspenderin steuert über den Zellsaft einige Gene für wichtige Almungspigmen bel Abb. 16: So könnte das Menschen eines Tages praktiziert werden Ziel Ersetzung von Krankem Gewebe rapeutische Klonen beim Stammzellen. Definition: Besondere Zellen mit folgen der Eigenschaften: 1) Was sind Stammzellen? können sich selbst erneuern →Tochterzellen bilden > können sich in spezialisierte Zellen umwandeln (differenzieren) Potientalität fähigkeit sich in alle Zellen des menschlichen Körpers zu differenzieren oder nur bestimmte Bellarten Omni= Stambellen sorgen im Embryo für Bildung aller Gewebe →→ Tolipotent → können vollständigen Organismus bilden bis 8-Zellstadium Pluripotent können sich in alle verschiedene Gewebe des Körpers differenzieren → es kann kein gesammter Organismus entstehen Multipotent verschiedene Zelltypen innerhalb eines Gewebetyps 2) Was können adulte Stamm >hallen Funktionen im Körper aufrecht len? Blutbildende system erneuerung von Zellen ↳ Wundheilung > Zellersatztherapien Erkrankungen wo eine bestimmte Zellart ausfallt 3) Wie werden adulte Stammzellen gewonnen? > sehr unterschiedlich > aus dem Knochenmark > aus dem Blut mithilfe von Wachstumshormonen > Nabelschnurblut Einteilung der Stammzellen: Totipotenz Aus einer Zelle kann ein neues Individuum entstehen. Befruchtete 4-bis 8- Eizelle > Regeneration >Differenzierung > Potentialität > unbegrenzte Teilung Zellstadium Muskel- zellen 4) Wo werden adulte Stammzellen eingesetzt? > Leukemie → Blutbildendes system des Patienten wird zerstört und durch Stamsellen des gesunden Spenders wieder aufgebaut → allogene Transplantation Pluripotenz Nicht mehr fähig, ein Individuum zu bilden, aber Vorläufer für sehr viele Zelltypen Bläschenkeim (Blastocyst) Nerven- zellen Foetus Embryonale Embryonale Embryonale Adulte Stammzellen (ES) Stammzellen (ES) Keimzellen (EG) Stammzellen (AS) Multipotenz Fähig, nur bestimmte Zelltypen zu bilden Junger Mensch, Erwachsener totipotente Stammzelle Blutzellen pluripotente Stammzelle Knochen- zellen Potenzial der Stammzellen Herkunft Stammzelltyp multipotente Stammzellen weitere Zelltypen Pränatale Diagnostik (PND) Umfasst eine Reihe von Untersuchungen während der Schwangerschaft, mit denen bestimmte Erkrankungen oder Fehlbildungen vor vor der Geburt festgestellt werden können. Nicht-invasive Verfahren Untersuchungen, die nicht direkt in den Körper. von Mutter oder Fetus eingreifen und gefahrlos für Mutter und Fetus sind. > Ultraschalluntersuchung → nur erhöhte Wahrsch. für Felbildung, keine Garantie > Untersuchungen des Blutes der lutter (molekulargenetischer Bluttest). vorallem wenn Chromosomenanomalien bestehen. Alter der Mutter oder Vorgeschichte erhöhtes Risiko für wegen Dabei wird DNA des Kindes, welches frei im mütterlichem Blut. Zirkuliert untersucht. Diese legt, genau wie die mütterliche DUA, in Form von DUA- Bruchstücken vor. Diese können schnell parallel sequenziert und dem jeweiligen Chromosomen. zugeordnet werden → Auswertung über spezielle Software. Die erhaltenen Sequenzen (reads) werden aussortiert → können. so den entsprechenden Chromosomen. Zugeordnet werden (Bild). → Menge der vorliegenden reads der einzelnen Chromosomen wird bestimmt. Referenzgenom dient als Vergleich, um der Norm abweichende Anzahlen von rea ablesen zu können. (Bild) 36 bp AAGCT... CTAGT... TAGGO... GCATG... 2 weitere Sequenzen 1 bioinformatische Zuordnung Sequenzierung und Chromosomenzuordnung 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 x y Chromosomen b) Chr1 ChrB ChrX Chr13 Chri Chr21 Chr18 Chry I usw. ■= reads Quantifizierung der DNA-Bruchstücke. a) Referenzgenom, b) Testergebnis Bei Fetus mit Trisomie 21 wird mehr zellfreie. DUA vom Chromosom 21 in den mütterlichen Kreislauf abgegeben als bei gesundem Fetus. → mehr DNA-Fragmente vom Chrom. 21 im Blut der. lutter nachweisbar → Aussage über das vorliegen einer Trisomie 21 Trisomie 21 Gendefekt vorhanden Zusatzinformation: Wird beim ungeborenen. Kind eine Behinderung diagnostiziert, ist Abtreibung. in Deutschland straffre: → kein Zeitliches Limit, da eines Schwangeren durch das Austragen des Kindes körperliche oder seelische schäden drohen würden. Invasive Verfahren. Untersuchungen, die in den Körper von Mutter und Fetus eingreifen > unter Ultraschallkontrolle mithilfe einer Kanüle werden Zellen des Fetus aus der Fruchtblase entnommen. Diese Zellen werden Labor vermehrt. Dann können die Chromosomen auf unregelmäßigkeiten untersucht werden. > Mutterkuchen-Untersuchung > Fruchtwasser-Untersuchung > Nabelschnurvenenpunktion →Sehr hohe Aussagekraft aber mit einem Risiko von 0,5-.3% für eine Fehlgeburt. verbunden Trisomie 21 In der 13.-14. Schwan gerschaftswoche wird Fruchtwasser entnom- men, Dies enthält Zel- len des Fetus. Dabei gibt es ein Fehlgeburts risiko von 3-5% Plazenta 3 Amniozentese Zentrifugation >Chromosom. 21. ist. 3- statt 2-mal in jeder Zelle vorhanden > Fehler bei verteilung der chromosomen in der Meiose → veränderte Chromosomenanzahl in Geschlechtsteilen. > Trisomie 21 entsteht, wenn sich in der Meiase 1 die homologen Zwei-Chromatid-Chromosomen 21, nicht trennen, oder sich in der Meiose 2 die Chromosomen des Zwei-chromatid- chromosomen 21 nicht trennen → Non-Dis-junction Über- stand Zellen des Fetus Gebärmutter biochemische Tests Mutterkuchen-Untersuchung (Chorionzottenbiopsie) Die Zelien des Fetus werden 2-3 Wochen in Zellkulturen ver mehrt und dann auf Chromoso menveranderun gen untersucht. 17 18 19 Fruchtwasser-Untersuchung Karyogramm (Amniozentese) Melose I Prophase normal Meiose I Telophase Chromosomen 21 ∞ Alo normal Non-Disjunction 0³0 Nabelschnurvenenpunktion Non-Disjunction 11.110000¯¯®®000 Meiose II Telophase schlechts- Anzahl der Chromo- somen in den Ge- schlechts- zellen 23 23 23 23 22 22 24 24 23 im 23 22 24 2 Non-Disjunction in der Meiose führt zu numerischen Chromo- somenaberationen diploide Urkeimzelle Prophase 1 Prophase 2 POON Eine weitere Zellteilung wird eingeleitet. replizierte (verdoppelte) DNA Ex. Paarung der Homologen 3 Crossingover Centromer (Bildung von Tetraden) Meiose 1-Trennung der homologen Chromosomen Kinetochor (Anker der Spindelfasem) X X XX Die Zwei-Chromatid-Chromoso- men verdichten sich langsam. Dabei lagern sich die Homolo- gen zur Tetrade aneinander und es findet ein Crossingover statt. Die Kernhülle löst sich 1 Die Meiose ist eine Zellteilung, bei der aus einer diploiden Urkeimzelle haploide Keimzellen mit neu kombinierten Chromosomen entstehen (hier dargestellt an 2n- 4 Chromosomen). (Mitose) Die Chromosomen ordnen sich auf der Aquatorialplatte an. Es bildet sich ein Spindelapparat. Chromatiden Zwei-Chromatid- Chromosom Metaphase 2 Metaphase 1 Die Tetraden ordnen sich auf der Aquatorial- platte an. Es bildet sich ein Spindelapparat. BX Ergebnis des Crossingover Meiose 2-Trennung der Chromatiden Chromatiden Anaphase 1 Die Spindelfasern ziehen die beiden Chromatiden jedes Chromosoms am Cen tromer auseinander. Die Spindelfasern trennen die homologen Chromo- somen voneinander, ohne die Centromere bzw. Chromatiden zu trennen. Anaphase 2 An jedem Pol liegen nun Ein-Chromatid- Chromosomen. Jedes enthält eine einzelne DNA-Doppelhelix. Telophase 1 An jedem Pol liegen nun Zwei- Chromatid-Chromosomen. Das Cytoplasma teilt sich in zwei Zellkörper. Die Chromosomen der Eltern sind zufällig auf die Tochterzellen verteilt. Ein-Chromatid- Chromosom Telophase 2 haploide Keimzellen Entstanden sind vier Keimzellen mit je einem haploiden Chromosomensatz, bestehend aus Ein-Chromatid-Chromo- somen. Sie sind neu kombiniert. Rekombination Definition: Neuordnung genetischer Informationen durch den Austausch von Allelen. Sie ist Voraussetzung Es gibt interchomosomale und intrachomosomale Rekombination Interchomosomal zwischen. Wenn genetisches Material zwischen den Chromosomensätzen getauscht wird → Während Meiose werden die homologen. Chromosomen auf die Tochterzellen aufgeteilt.. Dabei zieht der ↳ aus einem doppelten (diploiden) Chromosomensatz entsteht ein einfacher (haploider). Chromosomensatz. Spindelapperat in zufälliger Verteilung die homologen chromosomen aus der Aquatorialebene zu den Polen (Anaphase 1). intrachromosomal innerhalb Wenn genetisches Material innerhalb von zwei Chromosomen ausgetauscht wird → Während der Meiose müssen sich die homologen Chromosomen paare aneinanderlagern (Prophase) Wenn sich die Chromatiden überkreuzen, kann es zum crossing over kommen, bei dem Chromosom abschnitt und verbinden sich dann neu → Neuordnung verschiedenen Allele Dafür brechen die Chromalden auf Mitose und Meiose im Vergleich Wo? Ziel/ Funktion Ablauf (Meta-/ Anaphase): Ergebnis: Funktion: Mitose (= Kernteilung) In allen wachsenden Körperzellen Zellvermehrung Anordnung der Chromosomen in der Äquatorialebene Trennung der Chromatiden 2 Tochterzellen mit je 2 Sätzen (diploid, 2n) von Ein- Chromatid-Chromosomen Identische Weitergabe von Erbinformation: Tochterzellen sind genetisch identisch Wachstum durch Zellvermehrung Zellerneuerung (Regeneration) Meiose (= Reife-/ Reduktionsteilung) In den Eierstöcken bzw. Hoden Keimzellenbildung 1. Reifeteilung: - Anordnung der homologen Chromosomenpaare in der Äquatorialebene Trennung der homologen Chromosomenpaare 2. Reifeteilung: entspricht Mitosevorgängen aber nur mit haploidem Chromosomensatz Nach der 1. Reifeteilung: 2 Tochterzellen mit je 1 Satz (haploid, 1n) 2-Chromatid-Chromosomen (2c) Nach der 2. Reifeteilung: Keimzellen: 4 Spermien beim Mann bzw. 1 Eizelle (& 3 Polkörperchen) bei der Frau Neukombination des Erbgutes (Rekombination): zufällige Verteilung der Chromosomen auf die Tochterzellen (interchromosomale Rekombination) far • Crossingover (intrachromosomale Rekombination) Bildung von befruchtungsfähigen Geschlechtszellen (= Keimzellen) Reduzierung des Chromosomensatzes genetische Variabilität. getauscht Sexuelle und Asexuelle Fortpflanzung Lebewesen können sich auf zwei verschiedene Arten vermehren: Ergänze die Leeren Kästen in der Tabelle. Und die Definition, Klon". Eltem Zellen zur Fortpflanzung Entstehung der Zellen & genetische Information Geschlechtliche (sexuelle) Fortpflanzung Beispiele Zwei Partner (männlich, weiblich) nötig Spezialisierte Fortpflanzungszellen: Körper allen Keimzellen: Eizellen und Spermien (Tier)- bzw. Pollenzellen (Pflanzen) Die Zellen, die das neue Lebewesen bilden, entstehen durch Meiase rekombination der Genetick nier/nirachamosonal Nachkommen Befruchtung von Eizelle bestehen zur hälfte aus mütterlichem und väterlichem Genom →neu kombinierte genetische Inform. Säugetiere (innere Befruchtung (i.B.) Fische (äußere B.), Amphibien (ä.B.); Reptilien, Vögel (i.B.) Kein höheres Lebewesen kann sich auf Dauer ohne sexuelle Fortpflanzung erhalten Ungeschlechtliche (asexuelle, vegetative) Fortpflanzung Ein Elternteil Definition Klon: Durch ungeschlechtliche Fortpflanzung von Ter- und Pflanzen individuen entstandene Erbgleiche Nachkommen Die Zellen, die das neue Lebewesens bilden, entstehen nur durch Mitosen. Keine Befruchtung. Alle Nachkommen sind untereinander und mit ihrem elterlichen Organismus genetisch identisch-sie bilden einen Klon. Saßwasserpolypen Kartoffelpflanzen, Erdbeer pflanzen, Einzeller Vorteile Nachteile Vor- und Nachteile der Sexualität/ Asexualität Geschlechtliche (sexuelle) Fortpflanzung > Variabilität durch Neukombination von Genen→→→ Anpassungsfähigkeit > genetische Vielfalt →→ Vorteil gegenüber Feinden > wiederstandfähiger gegenüber Krankheitserregern, da sich Individuen nicht generisch gleichen. • Geschlechtspartner benötigt. • Vorgänge der Befruchtung und Keimesentwicklung komplex und störanfällig. Ungeschlechtliche (asexuelle, vegetative) Fortpflanzung Gefahr genetischer Defekte durch Meiose/Rekombination erhöht Reproduktion ohne Partner, schnell Sie kann auch stattfinden, wenn... ...kein Geschlechtspartner zur Verfügung steht. > Zwei Kopien eines Gens →→ Veränderungen einer kopie Bei Pflanzen: außern sich nicht phänotypisch...die Blüte erfriert oder die (sichtbar) Fruchtbildung missglückt ist oder keine Bestäubung stattfindet. Gründung einer Population in einem neuen Lebensraum mit einem Individuum möglich. Sehr rasche Ausbreitung möglich, Vorteil im Kampf um Lebensraum, Licht, Nährstoffe, Wasser (z. B. nach dem Winter durch Rhizome, Knollen...). > genetisches Material bleibt über Generationen, in Form zufällig auftretender Untationen identisch keine Durchmischung der Gene →leicht angreifbar für Krankheits- erreger (Parasiten)