Gentechnik/angewandte Genetik

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an Erbsen: -> Mendel wählte die Erbse, da sie in kurzer Zeit viele Nachkommen hervorbringt, außerdem ist sie ein Selbstbestäuber und Selbstbefruchter -> Mendel arbeitete mit reinerbigem Säätgut. Über zwei Jahre prüfte er, ob die äußeren Merkmale der Nachkommen noch denen der Eltern entsprachen -> Mendel verglich keine Merkmale von Arten, sondern individuelle Merkmale -> Mendel erfasste erfasste insgesamt sieben Merkmalspaare, verglich aber nur jeweils eins oder zwei miteinander. dadurch wurde das Vererbungesgeschehen überschaubarer -> Mendel hatte bei der Wahl seiner Forschungsobjekte Merkmalspaare betrachtet, bei denen das eine Merkmal dominant und das andere rezessiv war Durchführung der Kreuzungsversuche: 1. Pollenentnahme mit einem Tuschepinsel aus der Blüte einer Pflanze, die aus einem gelben Samen hervorgegangen ist 2. Kastration der Blüte einer Pflanze, die aus einem grünen Samen gezüchtet war, durch Entfernung der Staubblätter 3. Übertragung des entnommenen Pollens auf die Narbe der weiblichen Blüte und deren Schutz vor Fremdbestäubung FL F2 1. Mendel'sche Regel: Uniformitätsregel „Kreuzt man reinerbige Eltern (P), die sich in einem Merkmal unterscheiden, so sind alle Nachkommen (FI) untereinander gleich (uniform) р Mendel'sche Regeln FL 2z rot: weiß = 3:1 2. Mendel'sche Regel: Spaltungsregel „Kreuzt man zwei Individuen der Fl-Generation untereinander, so erhält man ind der F2-Generation eine Aufspaltung der Merkmale ind festen Zahlenverhältnissen: Bei dominant-rezessivem Erbgang = 3:1 Bei intermediären Erbgang =1:2:1 Dominant-rezessiver Erbgang: 2z 22 rz r2 w2 2 22 2₂ rw22 rwZz rrzz rw2z rwzz w2 rw22 rw2z ww22 wwZz wz rw2z rwzz wwZz wwzz rz р Wz Fl F2 Intermediärer Erbgang: ww rw ww rw rw weiß: rosa: rot=1:2:1 rw 3. Mendel'sche Regel: Unabhängigkeitskrieg-/ Neukombinationsregel: Kreuzt man homozygote Individuen (P), die sich in mehreren Merkmalen voneinander unterscheiden, so wird jedes Merkmal unabhängig von den anderen Vererbt" rw rw rr Monohybrider Erbgang: Bedeutet, dass nur ein unterschiedliches Merkmalspaar betrachtet wird. Dihybrider Erbgang: bedeutet, dass zwei unterschiedliche Merkmalspaare betrachtet werden Mutationen: →> Mutationen sind Veränderungen der genetischen Information, die unterschiedliche Phänotypen verursachen. Die entstandenen Organismen werden Mutanten genannt. -> Körperzellmutationen (somatische Mutationen) werden nicht auf die nächste Generation weitervererbt, sie setzen sich lediglich in den Abkömmlingen der betroffenen Zelle fort. Die Merkmale der veränderten Zellen können abweichen, wie z.B. dunklere Pigmentierung von Hautzellen, sodass Flecken entstehen. →> Keimzellmutationen wirken sich nicht auf den betroffenen Organismus aus. Erst in der nächsten Generation können sie phänotypisch in Erscheinung treten. Mutationsursachen: -> Fehler bei molekulargenetischen Prozessen wie der Replikation oder der DNA-Reperatur bzw. Fehler bei der Chromosomenverteilung während der Zellkernteilung bewirken häufig Mutationen -> während der Replikation können beispielsweise Fehlpaarungen entstehen, weil die Stikkstoffbasen in verschiedenen isometrischen Strukturen existieren und ständig ineinander umgewandelt werden. Fast alle fehlerhaften Paarungen werden dann durch die Reperatursysteme beseitigt. Nur wenige bleiben als Mutation übrig. -> bei menschlichen Eizellen haften vermutlich die homologen Chromosomenpaare währen der je nach Lebensalter unterschiedlich viele Jahre dauernde Meiose mit zunehmendem Alter fester aneinander, sodass die Trennung in der Anaphase erschwert ist. Dadurch können spontan Chromosomenfehlverteilungen entstehen. -> zahlreiche physikalische oder chemische Faktoren können als Mutagene Veränderungen im Erbgut induzieren Mutationen Mutationsformen: -> Mutationen können ganze Chromosomensätze, einzelne Chromosomen oder die DNA selbst verändern. Entsprechend der betroffenen Struktur werden einzelne Mutationsformen unterschieden. 1. Genommutationen: →> Veränderung der Anzahl der Chromosomen im Vergleich zum natürlichen Chromosomenbestand →> Man unterscheidet Abweichungen um gesamte Chromosomensätze (Euploidie) und Abweichungen der Anzahl einzelner Chromosomen (Aneuploidie) →> Trisomie 21 ist eine Aneuploidie-Mutation beim Menschen, bei der das Chromosom 21 dreifach vorliegt 2. Chromosomenmutationen →> Chromosomenmutationen sind Strukturveränderungen an Chromosomen, die über die Grenze eines einzelnen Gens hinausgehen →> in den veränderten Chromosomen kann die Menge (Deletion, Duplikation) oder die Lage (Inversion, Translokation) des Erbmaterials verändert sein -> Lagerveränderungen wirken sich meist nur gering auf den Phänotyp aus, lediglich seine Kreuzbarkeit ist erschwert 3. Genmutationen →> Veränderungen an Genen →> Genmutationen entstehen zufällig an beliebigen Stellen der Gene bzw. Chromosomen -> Es können einzelne Basen oder längere Genabschnitte betroffen sein →> je größer die veränderten Abschnitte sind (etwa ab 50.000 Basen), desto mehr ähneln die Auswirkungen, denen von Chromosomenmutationen -> durch Genmutationen entstehen neue Allele →> bei der Basensubstitution (Punktmutation), kommt es zum Austausch von Nucleotiden der DNA. Das während der Translation gebildete Polypeptid besitzt dann entweder eine andere Aminosäure oder hat sich bei einer sogenannten stummen Mutation" nicht verändert. -> durch Einfügen (Insertion), Verdopplung (Duplikation) oder Entfernen (Deletion) von Basen bzw. Genabschnitten verschiebt sich das Leseraster der mRNA am Ribosom. Infolge dessen bricht die Translation meist ab, da STOPP-Codone vorzeitig entstehen. Entstehung der Genmutation DNA TACACGCCGCTTATT AUGUGCGGCGAAVAA mRNA ▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬||| Met-Cys-Gly-Glu-STOPP Polypeptid Basensubstitution ohne Aminosäureaustausch ▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬TTT TACACGCCACTTATT AUGUGCGGUGA AUA A ▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬ Met-Cys-Gly-Glu-STOPP Deletion (Entfernen) mit Leserasterverschiebung TIITT▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬T TACAC CGCTTATT AUGUGGG GAAVAA ▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬ Met-Trp-Ala- Asn-..... Basensubstitution mit Aminosäureaustausch ▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬ TACACGCCGCATATT AUGUGCGGCGUAUAA _____________ Met-Cys- Gly-Val-STOPP Insertion (Einfügen) mit Kettenabbruch TIITTI▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬ TACACTGCCGCTTAT AUGUGACGG GAAUA ▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬LLLL Met-STOPP Basensubstitution mit Kettenabbruch TI▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬TIT TACACT GCTTATT AUGUGA GG GAAUAA ▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬ Met-STOPP Duplikation (Verdopplung) mit Leserasterverschiebung TIITTI▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬IITT TACAACGC CG CTTATT AUGUUGCG GC GAA UAA 11 Met-Leu-Arg-Arg-lle-... Erbkrankheiten die auf Mutationen zurückzuführen sind Häufig führen Mutationen zum Ausfall oder zur nachteiligen Veränderung von Proteinen und dadurch zu Erbkrankheiten. Man unterscheidet Mutationen, die Gonosomen bzw. Autosomen betreffen. 1. Gonosomal rezessiv bedingte Erbkrankheiten -> bei Männern führen X-Chromosomensatz rezessive Erbgänge aufgrund des einen X-Chromosoms immer zur Ausprägung des Merkmals > bei Frauen kommt es nur bei Homozygotie, die wesentlich seltener ist, zur Ausprägung des Merkmals LI X-chromosomal rezessive Erbgänge XY XaY Xx 9 AA XY XXa AA 1.2 Autosomal bedingte Erbkrankheiten XXa AA Hamophilie (Bluterkrankheit) -> wird X-chromosomal rezessiv vererbt und beruht auf einem Blutgerinnungsdefekt →> die Blutgerinnung erfordert das Zusammenspiel vieler einzelner Gerinnungsfaktoren -> bei Hämophilie A fehlt einer dieser Faktoren, der Faktor VIII (das antihämophile Globin) →> Verletzungen können zu lebensgefährlichen Blutverlusten führen. Bluter leiden unter Blutergüssen und neigen zu spontanen inneren Blutungen -> bei der Erstellung von Stammbäumen des europäischen Adels wurde die Bluterkrankheit nur bei männlichen Personen festgestellt Aa Aa Aa AA Aa Aa 오 aa AA aa ♂ XY XY Aa AA Aa Aa Erbkrankheiten Phenylketonurie (PKU): -> Genmutation auf dem Chromosom 12 AA xxa XaY XXa XX Aa Bluter Überträgerin Rot-Grün-Sehschwäche ->wird X-chromosomal rezessiv vererbt -> die verschiedenen Farben des Lichts werden in der Netzhaut von unterschiedlichen Zapfen registriert, die auf Rot, Grün oder Blau ansprechen -> die Farbtüchtigkeit für Rot und Grün wird durch zwei X-chromosomale Gene determiniert, die für Blau durch ein Gen auf dem Chromosom 7 -> für alle drei Gene sind Veränderungen bekannt, sodass Rot-, Grün- oder Blausehen gestört sein kann. Am häufigsten ist das Grünsehen (75%) gestört, dabei können Rot und Grün nicht unterschieden werden v. Hessen Alice Friedrich v. Hessen Heinrich Waldemar v. Preußen v. Preußen Alexandra v. Hessen Alexis v. Russland Königin Victoria Leopold v. Albanie Ruprecht Beatrice Moritz v. Victoria Leopold v. Battenberg Battenberg Eugenie Die meisten Erbkrankheiten sind autosomal-rezessiv. Wie auch der Familienstammbaum zeigt, ist ihr Erbgang relativ schwer zu diagnostizieren, denn Krankheiten kommen innerhalb einer Familie nur gelegentlich zu Ausbildung. Die Gefahr von Homozygotie ist bei Verwandtenehen besonders hoch Alfonso v. Gonzalo v. Spanien Spanien Albinismus: -> Genmutation u.a. im Chromosom II →> Epidermiszellen können das Enzym Tyrosinase nicht synthetisieren. Das Enzym ist erforderlich, um den Farbstoff Melanin zu bilden -> die Symptome sind eine blasse Haut, nicht pigmentiertes, weißes Haar und schwachblaue oder rötliche Augen, da bei fehlender Pigmentierung die Blutkapillare der Iris durchscheinen →> das Enzym Phenylalaninhydroxylase kann nicht gebildet werden, wodurch die Umwandlung von Phenylalanin in Tyrosin blockiert wird -> Phenylalanin häuft sich im Blut an und wird durch einen Nebenstoffwechselweg zu Phenylbrenztraubensäure umgewandelt. Beide Stoffe hemmen die kindliche Gehirnentwicklung, sodass unbehandelt eine irreversible geistige Behinderung auftreten würde, die zum Tod führt -> beim Screening von Neugeborenen wird auf PKU getestet. Wenn man dabei das Erbleiden feststellt, wird eine Therapie angesetzt, die aus einer phenylalaninarmen Diät besteht. Diese ist so abgestimmt, dass die essenzielle Aminosäure für den Aufbau des Organismus gerade in ausreichender Menge vorhanden ist und schädlich hohe Konzentration der Abbauprodukte vermieden werden. Stammbaum - Legende Geschlecht ♂ 요 Elternpaar Verwandtenehe Geschwister aa homozygoter Merk- malsträger tosomal- rezessiv) - erkrankt Aa Aa heterozygoter Merk- malsträger - Überträger nicht erkrankt Erbkrankheiten Sichelzellenanamie -> normales Hämoglobin besteht aus zwei a-Ketten mit je 141 Aminosäuren und zwei ß-Ketten mit je 146 Aminosäuren -> bei der Sichelzellenanämie befindet sich an der 6. Position jeder B-Kette anstelle von Glutaminsäure die Aminosäure Valin -> durch die veränderte Aminosäuresequenz wird aus normalen Hämoglobin A (HbA) das Hämoglobin S (HbS) -> die Erythrocyten nehmen bei Sauerstoffmangel (körperliche Anstrengung etc) eine sichelzellförmige Gestalt an → die Sichelzellen erhöhen die Viskosität des Blutes, verstopfen die Kapillaren und verursachen so zahlreiche Organschäden -> Bezüglich der Krankheit treten drei verschiedene Phänotypen auf: -> Homozygote Nichtmerkmalsträger (HbA, HbA) sind völlig gesund -> Heterozygote Träger (HbA, HbS) leiden meist nur bei Sauerstoffmangel an der Anămie →> Homozygote Träger (HbS, HbS) sterben meist schob sehr früh an den Folgen der Krankheit -> Sichelzellenanämie wird codominant vererbt ->in Europa ist die Sichelzellenanämie sehr selten -> in Malariagebieten Afrikas können bis zu 45% der Bevölkerung heterozygote Merkmalsträger sein. Chorea Huntington (Veitstanz) -> durch autosomal dominante Gene verursacht →> die Krankheit tritt phänotypisch erst spät (nach dem 40. Lebensjahr) auf und äußert sich im fortgeschrittenen Zustand in unkontrollierten zuckernden Bewegungen, die auf eine allmähliche Degeneration der Neuronen im Streifenkörper des Großhirns zurückzuführen sind →> die Gehirndegeneration führt zu mentalen Veränderungen und später zu Persönlichkeitsveränderungen, die schließlich zum Tod führen Reproduktionstechnologie -> die Reproduktionstechnologie beschäftigt sich mit den Möglichkeiten technischer Eingriffe in den Fortpflanzungsvorgang -> bei Pflanzen und Tieren dienen Reproduktionstechniken der künstlichen Produktion vieler erbleichter, eventuell gentechnisch veränderter Individuen -> in der Humangenetik werden Reproduktiostechniken v.a. eingesetzt, um kinderlosen Paaren ihren Kinderwunsch zu erfüllen Um Zellen in einer Zellkulturen zu halten und Züchten zu können, müssen sie bestimmte Voraussetzungen erfüllen: -> sie müssen gut aus dem Gewebeverband herauslösbar sein (Pektinase trennt Mittellamellen, Cellulase baut Zellwände ab) →> Zellen können entdifferenziert werden und sind durch Zellteilung in Kultur vermehrbar -> sie müssen die Fähigkeit zur Regeneration des Organismus aus einer Einzelzelle (=totipotente Zellen) haben Klonen Klonen -> Klonen umgeht die geschlechtliche Fortpflanzung und somit die Neukombination der Gene, so werden genetisch identische Individuen erzeugt. -> In der Reproduktionstechnik bezeichnet man als Klonen die Erzeugung eines Lebewesens, von Geweben oder Organen, ausgehend von der genetischen Information eines anderen (adulten) Lebewesens. Klonen bei Pflanzen Differenzierte, spezialisierte Zellen einer Pflanze können durch ihre chemische Umgebung dazu angeregt werden, sich zu entdifferenzieren. Diese Zellen verhalten sich dann wie frühe embryonale Stammzellen und bilden eine neue Pflanze. Beim klonen wird ein Gewebsstück mit differenzierten Zellen der zu klonenden Pflanze entnommen. Die differenzierten Zellen werden im Nährmedium kultiviert entdifferenziert. Die Zellen lösen sich aus dem Verband (Cellulase: löst die Zellwände auf; Pektinase: trennt die Zellen voneinander). die einzelnen Zelln beginnen sich zu teilen, nach Zugabe von Pflanzen (-Phyto)-Hormonen. Es entwickelt sich ein Kallus (Zellmasse). Die Kalli werden vereinzelt. Jeder Kallus wird in ein Nährmedium überführt und regeneriert eine Pflanze. zu klonende Pflanze geklonte Pflanze Gewebsstück in Nahrmedium Kallus entwickelt sich zu einer Pflanze einzelne Zelle Entwicklung zu einem Kallus Klonen bei Säugetieren Viele Nutztiere werden künstlich besamt mit dem Sperma ausgewählter Zuchttiere. Embryotransfer erhöht die Zahl möglicher Nachkommen von Zuchttieren mit herausragenden Eigenschaften, er wird in Kombination mit künstlicher Besamung oder mit einer In-Vitro-Fertilisation durchgeführt. Beim klonen wird der Kern einer Körperzellen der „genetischen Mutter" redifferenziert und in eine entkernte Eizelle der „Eimutter überführt. Der sich entwickelnde diploide Embryo wird in die Gebärmutter einer genetisch uninteressanten „Leihmutter" eingesetzt und von dieser ausgetragen. -> die Kerngene des Klons stammen von der „genetischen Mutter -> die Mitochondrialen Gene stammen von der „Eimutter genetische Mutter (#1) Leihmutter (#3) Zellkern Embryo Embryo wird in Gebärmutter eingesetzt Eizelle Eimutter (#2) genefisch identische Nachkommen von #1 Im Jahr 1996 kam das erste geklonte Schaf namens Dolly auf die Welt. Dolly starb 2003 an einer Lungenkrankheit. Im Laufe ihres Lebens paarte sie sich und gebar auf natürlichem Wege ein Lamm. Damit wurde die genetische Überlebensfähigkeit geklonter Säuger bewiesen. Restriktionsenzyme EcoRI Hind!!! Pstl Haelll Restriktionsenzyme Bei allen wichtigen Verfahren der Gentechnik werden Erbmoleküle entweder getrennt oder zusammengefügt. da auf molekularer Ebene aber keine mechanischen Werkzeuge funktionieren, nutzen man bakterielle Enzyme => Restriktionsenzyme. Restriktionsenzyme: -> Restriktionsenzyme erkennen bestimmte DNA-Sequenzen (Restriktionsschnittstellen) -> An der DNA-Sequenze heften sie sich an das Molekül um trennen die Verbindung zwischen dem Phosphat und der Desoxyribose des DNA-Strange -> die Schnittstellen der Enzyme sind häufig so gebaut, dass am Ende der DNA ein kurzer einsträngiger Abschnitt entsteht -> der Abschnitt kann sich spontan mit einem komplementären Abschnitt zusammenlagen (unter Ausbildung von Wasserstoffbrückenbindungen) -> bei Zugabe von DNA-Ligase, die die DNA-Molekule miteinander verbindet, kommt es zur Ausbildung einer festen Verbindung durch Phosphordiesterbindungen. Die dazu benötigte Energie wird meist in Form von ATP bereitgestellt. 5 3' in 3' 5 3 5 3' Es sind ca. 300 Restriktionsenzyme bekannt. Diese werden nach dem Herkunftsorganismus benannt: ->z.B. EcoRI bedeutet Escherichia Colin Restriktionsenzym Erkennungssequenzen 3' 5 5 3' 5 5' 3 5 3' 5 3 5 3' 5 3 Enden der Restriktionsfragmente 3 5 3 5' 5 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) -> die PCR ermöglicht es, die DNA schnell und relativ einfach zu vervielfältigen →> das Verfahren ist mit der identischen Replikation vergleichbar -> für die PCR werden benötigt: → DNA-Probe →> DNA-Nucleotide (dATP, dTTP, dGTP, dCTP) -> Primer (20-30 Nucleotide lang) →→ Hitzebeständige DNA-Polymerase (stammt aus dem thermophilen Bakterium ,Thermus aquaticus" oder aus Archäen) Ablauf: 1. Denauturierung: das Reaktionsgemisch wird auf 90°C-100°C erhitzt, dadurch lösen sich die Wasserstoffbrückenbindungen -> es entstehen DNA- Einzelstränge 2. Hybridisierung: das Reaktionsgemisch wird auch ca. 50°C abgekühlt. Anschließend binden die synthetischen Primer an die komplementären Sequenzen der Matrizen DNA 3. Polymerisation: die Komplementärstränge werden durch die hitzebeständige Taq-Polymerase synthetisiert Der einzelne Zyklus der PCR dauert in der Regel wenige Minuten und wird 30- bis 40-mal in einem Automat (Thermocycler) durchlaufen. -> bei 30 PCR-Zyklen wird jedes DNA-Fragment um den Faktor 2*30 vervielfältigt, was 1.073.741.824 Kopien sind Ausgangsmaterial: DNA PCR-Zyklus + DNA-Polymerase + 1. Trennung der DNA durch Erhitzen auf etwa 95°C PCR 2. Bindung der Primer durch Abkühlung (Hybridisierung) 3. Bindung der DNA-Polymerase Und Kettenverlängerung 4. DNA-Probe wurde verdoppelt => Ausgangsmaterial für den nächsten Zyklus T T DNA-Polymerase DNA-Nucleotide T T 95°C + Abkühlen Primer Will man mithilfe der PCR-Methode eine bestimmte Gensequenz nachweisen, benötigt man dazu zwei Primer. Mit diesen künstlich hergestellten 15-24 Bp langen Polynucleotidabschnitten legt man Anfang und Ende des zu kopierenden DNA-Abschnittes fest. Die Primer heften sich bei einem PCR-Nachweis an die nachzuweisende DNA-Sequenz an und starten einen Kopiervorgang. Die gesuchte Sequenz wird anschließend so oft vervielfältigt, bis eine analytisch messbare Menge vorhanden ist. T Die DNA einer einzigen menschlichen Zelle genügt, um sie einer bestimmten Person zuordnen zu können. Der sogenannte „genetische Fingerabdruck dient der Zuordnung von Spurenmaterial wie Blut, Sperma oder Speichel in der Kriminalistik, um Täter eindeutig zu identifizieren. Das Verfahren beruht darauf, dass die DNA verschiedener Menschen trotz weitgehender Übereinstimmungen bestimmte Sequenzunterschiede zeigt. Durchführung des Verfahrens: 1. die DNA des Spurenmaterials wird durch die PCR vermehrt 2. die vermehrte DNA wird durch Restriktionsenzyme zerlegt 3. Um die DNA-Fragmente aufzutrennen und nach ihrer Große zu sortieren nutzt man die Tatsache, dass die DNA leicht negativ geladen (sauer) ist. 4. DNA wird in einen Block aus feuchtem, festen Block aus Gel gegeben 5. auf das Gel mit der DNA wird eine niedrige elektrische Spannung gegeben. Weil die DNA negativ geladen ist, wandert sie im Gel zur positiven Elektrode →> je länger die DNA-Stränge sind, desto langsamer wandern sie (kurze Banden wandern schneller und weiter als lange) 6. Die Auftrennung erfolgt also durch unterschiedliche Wandergeschwindigkeiten entlang eines elektrischen Feldes in einem Potenzialität Gel (üblicherweise Agarose Gel) 7. Nach einer bestimmten zeit wird die Spannung abgeschaltet und die aufgetrennten DNA-Fragmente werden in Form von Banden mit dem Farbstoff Ethidiumbromid sichtbar gemacht => die Gelelektrophorese liefert Informationen über die Größe der DNA-Fragmente: →> kurze Fragmente wandern schneller/weiter →> lässt man DNA-Fragmente bekannter Länge als Marker parallel im selben Gel mitlaufen bekommt man genauere Informationen über die Länge der einzelnen Fragmente Gemisch aus DNA-Molekülen verschiedener Größen 20 15 10 -Kathode Beispiel anhand eines Vaterschaftstestes Gelelektrophorese Vater Mutter Kind 1 I T T Stromquelle Kind 2 Kind 3 Anode. längere Moleküle -Gel Stromquelle Wanderrichtung der DNA-Molekule kürzere Moleküle Southern Blotting ist ein Verfahren, welches zur Analyse von DNA-Fragmenten benötigt wird. Southern Blotting ermöglicht die Identifikation einer gesuchten DNA-Sequenz innerhalb der DNA. Durchführung: 1. die zu analysierende DNA wird isoliert und mit Restriktionsenzymen geschnitten 2. Auftrennung der DNA anhand ihrer Größe durch die Gelelektrophorese zusammen mit Marker-DNA-Fragmenten bekannter Länge Durch die Vielzahl der unterschiedlichen Größen der DNA-Fragmente entsteht ein Bandenmuster 3. Denauturierung: durch den Einsatz von Alkalien (Laugen) werden Doppelstränge der DNA in Einzelstränge gespalten 4. Das Bandenmuster, welches durch die Gelelektrophorese entstanden ist, wird auf eine Nylon- oder Nitrocellulosemembran übertragen (-Blotting) 5. nach der Fixierung auf der Membran werden die DNA-Einzelstränge mit einer radioaktiv, chemisch oder fluoreszierend markierten Gensonden behandelt. Die Gensonde besteht meistens aus einer RNA, welche zur gesuchten DNA-Sequenz komplementär ist 6. die Sonde bindet an die gesuchte Sequenz (=Hybridisierung) 7. anschließend werden die nicht gebundenen Sonden abgewaschen 8. am Schluss wird die Hybridbande sichtbar gemacht, z.B. durch einen Röntgenfilm. Die gesuchten Fragmente können aus dem Gel herausgeschnitten werden > stehen für weitere Schritte zur Verfügung Gemisch aus DNA- Molekülen verschiedener Größen 20 Southern-Blotting O 110 8 Kathode Bandenmuster Anode Sichtbarmachen durch zB. Röntgenstrahlung Schwamm Gel Papiertücher Pufferlosung Nitrocellulose- oder Nylonmembran einzelsträngige DNA oder RNA-Moleküle Die Membran wird mit einer Lösung eingeschlossen, die die markierten Sondenmoleküle enthält genetischer Fingerabdruck Ein genetischer Fingerabdruck hat das Ziel anhand der DNA eines biologischen Materials (z.B. Speichel, Blutanhaftungen, Hautzellen etc.) eine Person zu identifizieren. Das heißt, man braucht ein genetisches Muster, das für jede Person einzigartig ist. Jede Person besitzt DNA-Abschnitte, die sie von anderen Menschen unterscheidet. Die DNA-Abschnitte, die in irgendeiner Weise eine Information besitzen, werden in der Genetik Marker genannt. Man betrachtet jedoch nur die Marker im nicht codierenden Bereich, d.h. außerhalb von Genen, also an Orten die für unseren Phänotype (Aussehen, Gesundheit...) unwichtig sind. Es gibt sehr viele verschiedene Varianten an Markern, für den genetischen Fingerabdruck nutzt man jedoch heute nur noch die sogenannten short tandem repeat, kurz STRs. Short tandem repeats sind kurze Sequenzwiederholungen von nur wenigen Basenpaaren. STRS (Short Tandem repeats - Mikrosatelliten): -> STR Methode wird heutzutage häufiger genutzt als die RFLP-Methode -> STR treten in nichtkodierenden Bereichen der DNA auf und umfassen Muster von sich wiederholenden Basenpaarsequenzen, die zwischen zwei Restriktionsstellen liegen -> diese Basensequenz wird 10-50 mal wiederholt und ist 2-5 Basenpaare lang -> Die meisten STR-Systeme sind autosomale Systeme, dh. sie sind auf den Autosomen lokalisiert. Von diesen Chromosomen besitzt der Mensch einen doppelten Satz, einen einfachen Satz vom Vater und einen einfachen Satz von der Mutter. Ein Mensch hat folglich in jedem STR-System zwei Allele, ein väterliches und ein mütterliches. VNTRs (variable number of Tandem repeats - Minisatelliten) -> die VNTR-Methode wird sehr selten benutzt ->UNTRS treten ebenfalls im nichtcodierenden Bereich der DNA auf und umfassen eine sich wiederholende Basensequenz, die zwischen zwei Restriktionsstellen liegen -> die Basensequenz wird 100-1000 mal wiederholt und ist 12-100 Basenpaare lang RFLPs (Restriktionsfragmentlangen-Polymorphismus) →> hat zur Grundlage, dass sich jeder Menschim nicht-codierenden Intronbereich der DNA unterscheidet -> Punktmutationen im Bereich von Restriktionsstellenm die zum Verlust oder Neuerwerbung einer restriktionsstelle führt Durchführung genetischer Fingerabdruck mit den RFLPs: →> DNA von verschiedene Menschen wird durch Restriktionsenzyme geschnitten →> DNA-Fragmente unterscheiden sich aufgrund der RFLPs in ihrer Länge →> die einzelnen Fragmente werden mit Hilfe der Gelelektrophorese aufgetrennt und dann sichtbar gemacht Beispiel STRS: www. EXON INTRON ATG - ATG - ATG - ATG - ATG - ATG - ATG - ATG - ATG - ATG 10 Wiederholungen der Sequenz ATG zwischen den zwei Restriktionsstellen DNA-Sequenzierung nach SANGER: →> Die Sequenzierugn nach SANGER beruht auf einem zufälligem Kettenabbruch durch Didesoxynucleotide (ddNTP) bei einer synthetischen DNA-Replikation -> man benutzt das Kettenabbruchverfahren um eine komplette Basenabfolge eines Genoms zu entschlüsseln →> zu Beginn Vervielfältigt man die DNA durch PCR -> anschließend denauturiert man die DNA zu Einzelsträngen -> Man benötigt: -DNA-Polymerase -DNA-Nucleotide DNA-Sequenzierung - (radioaktiv-) markierte Primer - Abbruchmolekule (ddNTP) (im Verhältnis 1:200) -> die DNA wird in vier verschiedenen Ansätzen repliziert, von denen jedes eines der vier Abbruch Nucleotide enthält -> wenn die Abbruch Nucleotide am DNA-Strang bindet, kann am 3 'Ende keine Estterbindung mehr eingegangen werden -> Dadurch entstehen unterschiedlich lange Fragmente, die jeweils mit einer bestimmten Base am 3' Ende enden -> mit der Gelelektrophorese lassen sich die Fragmente der Länge nach auftrennen -> die Abbruchbase ist eindeutig markiert, so dass sich aus der Reihenfolge der Fragmente die Basenfolge der Sequenz lesen lässt ddATP Wanderrichtung während der Gelelktrophorese DNA 5 (radioaktiv-) markierter Primer ddCTP A C GT Leserichtung ddGTP längstes Fragment 3₁ A G vo veverin kürzestes Fragment 5' C A T G C с A M ddTTP zu analysierende Sequenz 3'komplementärer Strang Herstellung rekombinierter DNA Vektoren Herstellung rekombinierter DNA: Die meisten gentechnischen Veränderungen basieren auf folgendem Prinzip: 1. Isolierung der Spender-DNA: →> die Membranen der Zellen und Zellkerne der Spenderzellen werden zerstört und die Proteine enzymatisch abgebaut -> die Spender-DNA wird durch Restriktionsenzyme in kleine DNA-Fragmente (mehrere tausend Basenpaare) zerlegt ->nur kleine DNA-Abschnitte sind stabil genug, um kloniert zu werden, dh. In eine anderes Bakterium übertragen und dort vervielfältigt zu werden →> größere Fragmente enthalten Möglicherweise unerwünschte Gene, deren Produkte die Wirtszelle belasten können 2. Isolierung und Aufschneiden eines geeigneten Vektors: -> zum Aufschneiden des Vektors wird dasselbe restriktionsenzym eingesetzt, das zum Zerschneiden der Spender-DNA verwendet wurde 3. Hybridisierung: →> Verknüpfung der Vektor-DNA mit der Spender-DNA durch Ligasen 4. Transformation -> Übertragen der neu kombinierten (rekombinierten) Vektor-DNA auf Zellen eines Empfängerorganismus (meist E-coli-Bakterien) 5. Selektive Identifizierung: -> selektive Identifizierung und Vermehrung der Wirtszelle, die den rekombinierten Vektor aufgenommen haben, also die gewünschte Genkombination besitzen -> es entsteht eine Population von Zellen mit identischem Erbgut, ein Klon Vektoren: Vektoren (Genfähren) sind Transportmittel zur Übertragung von Fremd-DNA in Wirtszellen. Vektoren müssen folgende Eigenschaften aufweisen: -> sie müssen replizierter sein. Es muss also eine Erkennungssequenz für Replikationsenzyme geben. -> sie müssen einfach und in großen Mengen zu isolieren sein. -> sie sollten geeignete Schnittstellen für verschiedene Restriktionsenzyme haben, um den Einbau von Fremd-DNA zu ermöglichen. Der jeweils verwendete Vektor muss mit dem gleichen restriktionsenzym (oder einem mit gleicher Erkennungssequenz) aufgeschnitten werden wie die Spender-DNA (gleiche ,,sticky-ends") -> sie müssen der Wirtszelle eine besondere Eigenschaft verleihen, damit die Träger des Vektors erkannt und selektiv vermehrt werden können (genetische Marker für die Selektion z.B. Gene, die Resistenz gegen Antibiotika verleihen oder eine Gen für ein Enzym, das die Wirtszelle selbst nicht bilden kann) Plasmid als Vektoren: →> Plasmide sind kleine ringförmige DNA-Moleküle in Bakterien mit einer begrenzten Anzahl von Genen (ca. 2.000-10.000 Nucleotide) -> die Plasmidgene codieren keine wesentlichen Funktionen für die Bakterienzelle, befähigen diese jedoch oft zu ungewöhnlichen Stoffwechselleistungen, die ihr nützlich sein können (z.B. Antibiotikaresistenz) Viren als Vektoren: -> Viren sind subzelluläre Lebensformen, die genetische Information übertragen -> Viren als Vektoren haben gegenüber Plasmiden den Vorteil, dass man größere DNA-Fragmente zur Genübertragung einbauen kann als in Plasmide und dadurch eine hohe Zahl von Nachkommen erhält Übertragung von fremden Erbanlagen: Organismen, deren Genom durch die gezielte Übertragung von fremden Erbanlagen verändert wurde, werden Transgen genannt. Transgene Organismen sind also Organismen, die mindestens ein zusätzliches fremdes Gen besitzen, das in ihr Genom integriert wurde. Transgene Organismen Zur Erzeugung Transgener Zellen sind grundsätzlich 5 Schritte notwendig: 1. Isolation der Spender-DNA 2. Fragmentierung der Spender-DNA 3. Rekombination der DNA (z.B. in einen Plasmid oder Virus) 4. Transfektion/Transformation von Empfängerzellen (-Übertragung der rekombinierten Spender-DNA in Empfängerzellen) 5. Selektion Transzendenz Empfängerzellen Plasmid mit Ampicillin-Resistenz-Gen und ß-Galaktosidase-Gen Plasmid mit zwei Marker Genen (AmpR-Gen; ß-Gal-Gen) wird isoliert und mit dem entsprechenden Restriktionsenzym geschnitten Blaue Kolonien: Plasmid ohne Fremd-DNA Weiße Kolonien: Plasmid mit Fremd-DNA Bakterium ohne Plasmid go es wird mit den entsprechenden Restriktionsenzymen geschnitten C 90⁰ Bakterium mit Plasmid aber ohne Fremd-DNA Mo aufnahmebereite Bakterien Die Spender-DNA wird in das Plasmid eingefügt. Die Spender-DNA passt genau in den Plasmid, da sie die gleichen ,sticky-ends" hat wie das geschnittene Plasmid 90⁰ Das Human-Insulin-Gen wird aus der Spender-DNA isoliert Bakterium mit Plasmid und Fremd-DNA 90⁰ Die Bakterien werden auf ampilicinhaltige Nährboden gegeben, die den Zucker X-Gal enthalten. Dadurch können nur die Bakterien mit einem Plasmid wachsen (weiße und blaue Kolonien) Die Bakterien mit Fremd-DNA (weiße Kolonien) werden isoliert und anschließend in größeren Kulturen vermehrt. Herstellung transgener Organismen Nutzung transgener Organismen Erzeugung transgener Tiere: -> es werden Eizellen entnommen und noch vor der Befruchtung im Reagenzglas behandelt, indem man mit einer sehr dünnen Nadel einige 1000 Kopien der zu transferierenden DNA in die Eizelle injiziert -> nach der Kernverschmelzung werden die so behandelten Zygoten in den Uterus von Ammentieren implantiert -> nur ein kleiner Teil dieser eingepflanzten Zygoten entwickelt sich zu gesunden Nachkommen -> wiederum ein kleiner Teil dieser Nachkommen enthält das Transzendenz -> Mithilfe von PCR und Gensonden lässt sich feststellen, in welchen Nachkommen das Transgen tatsächlich stabil in das Genom eingefügt wurde -> diese transgenen Tiere werden dann weiter vermehrt Nutzung von transgenen Organismen: Industrielle Biotechnologie: -> dort werden transgenen Mikroorganismen oder Zellkulturen dazu eingesetzt, Substanzen herzustellen oder zu verändern, die für die Produktion von Lebensmitteln, Vitaminen, Aromastoffen, Medikamenten und unterschiedliche Chemikalien genutzt werden können -> als erstes Medikament wurde das menschliche Insulin 1980 im industriellen Maßstab mit transgenen Bakterien hergestellt. Das Hormon wird zur Behandlung der Zuckerkrankheit eingesetzt und senkt den Blutzuckerspiegel ->das menschliche Insulin besteht aus insgesamt 51 Aminosäuren, die eine A- und B-Kette bilden. Beide Ketten sind durch Disulfidbrücken miteinander verbunden -> in den ß-Zellen der Bauchspeicheldrüse wird zuerst ein IIO Aminosäuren langes Prä-Proinsulin synthetisiert, das dann im Golgi-Apparat seine funktionstüchtige Raumstruktur erhält und abgegeben werden kann -> für die Herstellung wurden E.-Coli-Bakterien mit einem Plasmid als Vektor Rekombiniert ->die Insulinherstellung verläuft in drei Stufen: 1. die Bakterien werden in Bioreaktoren vermehrt und das Fusionsprotein wird gebildet 2. das Protein wird dann aus den abgetöteten Bakterien isoliert 3. durch falten und Abspalten der überschüssigen Aminosäuresequenzen entsteht aus dem Fusionsprotein das Insulin Pflanzenzüchtung -> in der Pflanzenzüchtung ist genome Editing" schon relativ weit fortgeschritten: -> bei Erdnüssen versucht man, Allergene auszuschalten →> Kakao-Pflanzen sollen gegen Krankheiten resistent werden -> bei Mais wird die Trockenresistenz verbessert →> beim Raps will man die Platzfestigkeit von Schoten verstärken Humangenetik: →> besonders viel Aufsehen erregte 2018 die nicht genau nachprüfbare Meldung eines chinesischen Forschers, der mithilfe der CRISP/Cas9-Methode menschliche Zwillinge gegen HIV immun gemacht haben soll Mit Hilfe der Gentechnik können gezielt Fremdgene in Organismen eingebracht werden. Für den Gentransfer stehen verschiedene Methoden zur Verfügung: -> bei Prokaryoten dringt die DNA im einfachsten Fall durch eine porös gemachte Membran in die Zelle ein. Dies wird z.B. durch Salzbehandlungen oder durch Zugabe von oberflächenaktiven Polyethylenglykol erreicht Methoden des Gentransfers Der Gentransfer bei Eukaryoten ist etwas komplizierter als z.B. bei Bakterien, da die Fremd-DNA erst in den Zellkern gelangen muss, um in das Wirstgenom eingebaut werden zu können: -> Mikroinjektion: Mit einer feinen Kanüle werden die Zell- und die Kernmembran durchstochen. Die Fremd-DNA wird direkt in den Kern injiziert -> Liposomen: die Fremd-DNA wird von einer künstlich hergestellten Doppellippidschicht eingeschlossen. Die so entstehenden Vesikel werden als Liposomen bezeichnet. Sie verschmelzen mit der Doppellippidschicht der Zellmembran und entlassen die Fremd-DNA ins Zellinnere. →> Viren: die fremd-DNA wird in ein wirtsspezifisches Virus eingebaut. Das Virus infiziert die Zelle und schleust dabei die Fremd-DNA ein. -> UV-Laser: mit Hilfe eines UV-Lasers werden kleine Löcher in Zellwand und Membran gebrannt die sich nach 5 sek. wieder schließen. In dieser Zeit kann Fremd-DNA eindringen -> Elektroporation: durch elektrische Entladungen werden vorübergehend Löcher in der Zellmembran erzeugt, durch die fremd-DNA aus dem umgebenden Medium eindringen kann →> Partikelpistole: kleine Goldpartikel werden mit Fremd-DNA beschichtet, damit beschießt man die Zelle. dabei gelangen beladene Partikel in den Zellkern Mikroinjektion domo Liposom ) reelleee mors lelleve Virus your 4 Partikelpistole UV-Laser Elektroporation Gentherapie: Somatische Gentherapie: angewandte Genetik -> bei der Gentherapie wird das Genom von Körperzellen verändert. -> diese Veränderungen werden nicht an die nächste Generation weitergegeben Keimbahntherapie: -> bei der Gentherapie wird an den Keimzellen oder ihren Vorläufern angesetzt -> die genetischen Veränderung werden an die Nachkommen weitergegeben -> in Deutschland ist die Keimbahntherapie durch das Embryonenschutzgesetz von 1991 bis heute verboten Prinzipiell können bei der Gentherapie verschiedene Vorgehensweisen unterschieden werden: -> Austausch eines krankmachenden Gens (wirkungsvoll bei Monogen bedingten Erbkrankheiten) -> Hemmung eines im Genom schädlich wirkenden Fremdgens (z.B. von dauerhaft integrierten viralen Genen wie HIV) -> Einführung von zusätzlichen Genen, die für therapeutisch wirksame Proteine codieren (z.B. indem Gene für Proteine eingesetzt werden, die bestimmte Zellen zerstören oder den normalen Zellzyklus wiederherstellen) Lebensmittelherstellung: Um volle, reife, vitale Lebensmittel herzustellen wird eine Fremd-DNA in den Organismus eingesetzt. Dadurch stellen Produktionsorganismen mehr der benötigten Stoffe her. Herstellungsverfahren: In der Nahrungsmittelherstellung gibt es verschiedenen genetische Methoden: →> Nahrungsmittel, die sich selbst genetisch verändern →> Nahrungsmittel, die genetisch veränderte Organismen enthalten →> Nahrungsmittel, die von genetisch veränderten Organismen erzeugt werden Das Ziel der genetischen Veränderung ist die Produktivität durch kürzere Herstellungszeiten zu steigern Pflanzenzucht: In der Pflanzenzucht wird durch Gentechnik die Erhöhung des Ertrags und der Robustheit erreicht, außerdem eine erhöhte Resistenz und die Optimierung von Stoffwechselprozessen. Methoden: →> Mikroinjektion →→ Viren -> UV-Laser -> Elektrooperation →> Partikelpistole →> Liposomen Diagnostik: Gentechnik in der Diagnostik wird eingesetzt um frühzeitig Diagnosen zu erstellen. Wird auch zur Erkennung von Krankheiten, um Täter eindeutig zu identifizieren oder um eine Vaterschaft nachzuweisen eingesetzt → Untersuchung von Krankheitsursachen →> direkter Nachweis von mutierten Genen -> indirekter Nachweis von mutierten Genen →> Gentests