Gentechnische Herstellung von Insulin GENETIK

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der PCR (polymerase chain reaction) vervielfältigt, damit auf diese Weise mehr Insulin produziert werden kann. Spezifische Restriktionsenzyme werden daraufhin zu der vervielfältigten DNA gegeben, damit diese das Insulin-Gen auf der menschlichen DNA der Zellen ausschneiden können. Parallel zu dem Vorgang der Vorbereitung des menschlichen Insulin-Gens verläuft ein weiterer Prozess zur gentechnischen Herstellung des Insulins. Hierbei handelt es sich um einen Vorgang bei prokaryotischen Zellen, den Bakterien. Bakteri enthalten im Gegensatz zu den eukaryotischen Zellen sogenannte Plasmide, also ringförmige DNA-Moleküle. Wie auch schon bei den Insulin produzierenden Zellen werden die Bakterienzellen geöffnet und dabei sowohl die Zellmembran, als auch die Zellwand aufgebrochen. Die Plasmide werden gereinigt, sodass sie anschließend nur noch alleine ohne andere Bestandteile der Zellen wie Proteine oder Zellorganellen vorliegen. Dies wird elektrophoretisch kontrolliert, indem ein Längenstandard vorgibt, wie groß bzw. geladen die Plasmide nach der vollständigen Reinigung sein dürfen. Im Idealfall, also bei vollständiger Reinigung aller Plasmide, sollten sich diese nach der Elektrophorese alle auf einer Bande, auf Höhe des Längenstandards, befinden. Wurde die elektrophoretische Kontrolle durchgeführt, werden den Plasmiden Restriktionsenzyme hinzugefügt, welche die Plasmide aufschneiden. Im Folgenden werden die beiden bisher parallel zueinander ablaufenden Prozesse des Insulin- Gen-Präparation und der Plasmid-Vorbereitung zusammengeführt. Es liegt nun das ausgeschnittene Insulin-Gen und das aufgeschnittene Plasmid vor. Beide werden in einem entsprechenden Gefäß zusammen mit einer spezifischen Ligase zusammengeführt. Die Ligase wirkt wie eine Art ,,Kleber" und fügt Insulin-Gene und Plasmide zusammen. Dadurch nimmt das aufgeschnittene Plasmid das freie Insulin-Gen auf und verbindet es miteinander, sodass ein neues Plasmid mit eingefügtem Insulin-Gen entsteht. Das Besondere ist, dass das Insulin-Gen in das Gen für die Tetracyclin-Resistenz des Bakteriums eingebaut wird. Bei Tetracyclin handelt es sich um ein Antibiotikum. Damit wird die Tetracyclin-Resistenz des Bakteriums aufgehoben. Elektrophoretisch wird kontrolliert. ob das Insulin-Gen eingebaut wurde. Dafür wird erneut der Längenstandart der ersten Elektrophorese genutzt. Wurde das Insulin-Gen eingebaut, so muss das Plasmid größer sein als bei der ersten Kontrolle. Die Elektrophorese bietet aber keine hundertprozentige Sicherheit, dass das Insulin-Gen eingebaut wurde. Die Plasmide werden zurück in die Bakterien eingebracht. Dazu gibt es verschiedene mögliche Methoden. Um zu kontrollieren, ob die Plasmide in die Bakterienzellen aufgenommen wurden, wird das Ampicillin-Resistenzgen auf dem Plasmid benötigt. Auch bei Ampicillin handelt es sich um ein Antibiotikum. Alle Plasmide besitzen diese Resistenz, sodass einfach nachgewiesen werden kann, ob die Bakterienzellen die Plasmide aufgenommen haben. Die Bakterien werden auf eine Ampicillin-Platte gegeben. Nur die Bakterien überleben, die ein intaktes Ampicillin- Resistenzgen aufweisen können, also ein Plasmid eingebaut haben. Mit diesen wird im Folgenden weitergearbeitet. Um eine sichere Kontrolle zum Einbau des Insulin-Gens durchzuführen, müssen die Plasmide auf tetracyclinhaltige Platten gegeben werden. Sterben die Bakterienkulturen dort ab, erhält man die Sicherheit, dass das Insulin-Gen eingebaut und dadurch das Gen für die Tetracyclin-Resistenz inaktiviert wurde. Um die gewünschten und für die Insulinherstellung notwendigen Bakterienkulturen durch diese Kontrolle aber nicht zu töten, wird die sogenannte Stempeltechnik angewendet. Dabei wird mithilfe eines Stempels aus Samt eine Kopie der Bakterienkolonien in einer Petrischale angefertigt, welcher daraufhin auf die Tetracyclin-Platte gedrückt wird. Da die Kopie der Bakterienkolonien identisch zu den ursprünglichen Bakterienkolonien ist, lässt sich so nach einiger Zeit feststellen, welche Bakterienkolonien überlebt haben und welche aufgrund des inaktiven Tetracyclin- Resistenzgens abgestorben sind. Letztere Zellen werden selektiert, geöffnet und das Insulin, welches nun in den Bakterien produziert wird, gereinigt und kann abschließend zur Herstellung des Medikaments gegen Diabetes verwendet werden.