Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und Genetischer Fingerabdruck

Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

Die PCR-Methode einfach erklärt ist ein Verfahren zur Vervielfältigung bestimmter DNA-Abschnitte im Reagenzglas (in vitro).

Anwendungen der PCR:

• Erkennung von Erbkrankheiten und Virusinfektionen
• Erstellung und Überprüfung genetischer Fingerabdrücke
• Klonieren von Genen
• Durchführung von Vaterschaftstests

Wichtige Komponenten:

• Original-DNA als Vorlage
• Zwei Primer (Startmoleküle)
• DNA-Polymerase $häufig Taq-Polymerase$
• Desoxynukleosidtriphosphate (Bausteine)
• Mg²⁺-Ionen und Pufferlösung
• Thermocycler (spezielles Gerät)

Ablauf der Polymerase-Kettenreaktion $25-50 Zyklen$:

1. Denaturierung (95°C): Aufbrechen der DNA-Doppelstränge
2. Primer-Hybridisierung $50-65°C$: Anlagerung der Primer an einzelne DNA-Stränge
3. Elongation $68-72°C$: Auffüllen der fehlenden Stränge durch die DNA-Polymerase, wobei der Tochterstrang von 5' zu 3' aufgebaut wird

Wichtiger Prozess: Bei der Elongation PCR baut die Polymerase immer vom 3'-Ende des Primers beginnend den komplementären Strang auf. Dabei bleibt der Primer dauerhaft an der DNA gebunden und wird mit jedem Zyklus vervielfältigt.

Genetischer Fingerabdruck

Der genetische Fingerabdruck nutzt den Vergleich von individuellen DNA-Bereichen zur eindeutigen Identifikation einer Person.

Grundprinzip:

• Analyse kurzer, wiederholter DNA-Sequenzen (Short Tandem Repeats, STRs)
• STRs bestehen aus 2-5 Nukleotiden, die sich unterschiedlich oft wiederholen
• Die Länge und Anzahl der Wiederholungen ist individuell charakteristisch
• Nach PCR-Vervielfältigung erfolgt die Auftrennung mittels Gelelektrophorese

Ablauf zur Erstellung eines genetischen Fingerabdrucks:

1. DNA-Extraktion aus biologischem Material (Speichel, Blut, Hautschuppen)
2. Vorbereitung des PCR-Ansatzes (DNA, Primer, Polymerase, Nukleotide)
3. Durchführung der PCR
4. Anfärbung des PCR-Ansatzes und Auftragen auf Agarosegel
5. Auftragen eines Marker-Cocktails mit DNA-Fragmenten bekannter Länge
6. Durchführung der Gelelektrophorese
7. Ablesen und Vergleichen des individuellen Bandenmusters

Anwendungsbeispiel: In der Kriminalistik wird der genetische Fingerabdruck genutzt, um Tatverdächtige mit am Tatort gefundenen DNA-Spuren zu vergleichen. Die Methode ist so präzise, dass die Wahrscheinlichkeit für identische Muster bei nicht verwandten Personen extrem gering ist.

Genübertragung mittels Vektoren

Gentransfer einfach erklärt bezeichnet die Übertragung eines oder mehrerer Gene in eine Empfängerzelle. In der Molekularbiologie dient ein Vektor als Transportvehikel, um DNA-Sequenzen in Zielzellen einzuschleusen.

Plasmide als Vektoren:

• Kleine, meist ringförmige DNA-Moleküle
• Kommen natürlicherweise in Bakterien vor
• Dienen Bakterien zum natürlichen DNA-Austausch
• Können in der Gentechnik für den Transfer in pflanzliche, tierische und menschliche Zellen genutzt werden

Anwendungsziele:

• Herstellung von Medikamenten
• Gentherapie bei Erbkrankheiten
• Genetische Veränderung von Kulturpflanzen

Wichtiges Konzept: Der Vektor-Plasmid Unterschied liegt in der Funktion: Ein Plasmid ist ein DNA-Molekül, während ein Vektor ein Werkzeug (oft ein modifiziertes Plasmid) zum gezielten Gentransfer darstellt. Jeder Plasmid-Vektor ist ein Plasmid, aber nicht jedes Plasmid ist ein Vektor.

Ablauf der Genübertragung mittels Vektoren

1. Isolation:

• Restriktionsenzyme schneiden das Zielgen aus menschlicher DNA heraus
• Jedes Enzym erkennt spezifische Palindrom-Sequenzen
• Nach dem Schneiden entstehen "sticky ends" (überhängende Einzelstränge)
• Plasmide werden mit dem gleichen Enzym geschnitten

2. Rekombination:

• Die "sticky ends" der Fremd-DNA verbinden sich mit denen des Plasmids
• Das Enzym Ligase verknüpft die Lücken in den Zucker-Phosphat-Ketten
• Es entsteht ein Gemisch aus rekombinierten und nicht-rekombinierten Plasmiden

3. Gentransfer:

• Plasmide werden als Vektoren in Bakterien eingebracht
• Die Zellmembran der Bakterien wird durchlässig gemacht
• Es entstehen drei Bakterientypen: mit Plasmid und Fremdgen, mit Plasmid ohne Fremdgen, ohne Plasmid

4. Selektion:

• Vektoren tragen zwei Antibiotikaresistenzgene als Marker
• Einbau der Fremd-DNA unterbricht eines der Markergene
• Selektion erfolgt auf Agarböden mit verschiedenen Antibiotika:
  • Erster Agarboden: Antibiotikum gegen das beide rekombinierte Bakterienarten resistent sind
  • Zweiter Agarboden: beide Antibiotika (nur Bakterien ohne Fremdgen überleben)
• Vergleich der Muster identifiziert Bakterien mit Fremdgen

5. Zellvermehrung:

• Bakterienkulturen mit Fremdgen werden vermehrt
• Die Bakterien produzieren dann das gewünschte Protein (z.B. Insulin)

Praktisches Beispiel: Bei der Insulin-Produktion wird das menschliche Insulin-Gen in Bakterien eingeschleust. Die Bakterien vermehren sich schnell und produzieren große Mengen des Hormons, das für Diabetiker lebenswichtig ist. Diese Methode hat die Insulingewinnung aus Tieren weitgehend ersetzt und stellt sicher, dass das Hormon exakt der menschlichen Version entspricht.