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Gentechnologie: PCR, Genetischer Fingerabdruck, Gentransfer/ Genübertragung mittels Vektor

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 Werkzeuge und Verfahrensschritte der Gentechnologie
Polymerase-Ketten-Reaktion
(PCR)
Verfahren zur Vervielfältigung kurzer (genauer definie

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Werkzeuge und Verfahrensschritte der Gentechnologie: PCR (polymerase-chain-reaction/ Polymerase-Ketten-Reaktion, Genetischer Fingerabdruck, Gentransfer/ Genübertragung mittels Vektor

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Werkzeuge und Verfahrensschritte der Gentechnologie Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) Verfahren zur Vervielfältigung kurzer (genauer definierter Teile der) DNA-Basensequenzen in vitro (im Reagenzglas). Anwendung: Erkennung von Erbkrankheiten und Virusinfektionen, erstellen und überprüfen genetischer Fingerabdrücke, Klonieren von Genen, Vaterschaftstests Grundlegende Komponenten: Original-DNA, zwei Primer, DNA-Polymerase, Desoxynukleosidtriphosphate, Mg2+lonen, Pufferlösung, Thermocycler Ablauf der PCR: 25 bis 50 Zyklen in einem Thermocycler. Jeder Zyklus besteht aus drei Schritten: 1. Denaturierung (Schmelzen): Die doppelsträngige DNA wird auf ca. 95°C erhitzt, um die Stränge zu trennen. 2. Primer Hybridisierung (primer Annealing): Absenkung der Temperatur auf 50-65°C bewirkt Anlagerung der Primer an die einzelnen DNA template with sequence of interest 5' 3' dNTPs Primers Polymerase Denaturation 1st cycle 2 Annealing 3 Extension 5' Genetischer Fingerabdruck Im Verfahren des genetischen Fingerabdrucks benutzt man den Vergleich von besonders unterschiedlichen DNA- Bereichen, um einen Menschen zufällig zu identifizieren. Man analysiert kurze hintereinanderliegende Wiederholungssequenzen in den Basenpaaren der DNA, sog. Shorttandemrepeats (STRs). Die STRs können von zwei bis zu fünf Nucleotiden lang sein. Sie liegen direkt hintereinander und können sich unterschiedlich oft wiederholen. Die unterschiedlichen Längen und Wiederholungen der STRs sind für jeden individuell charakteristisch. Nach einer Vervielfältigung durch die PCR-Methode in einer Gelelektrophorese können diese bestimmt werden und das entstandene Bandenmuster ist dann der genetische Fingerabdruck. Anwendung: z.B. VaterschaftstestAblauf der Erstellung eines genetischen Fingerabdrucks: 1. DNA wird extrahiert (aus Speichel, Blut, Hautschuppen) 2. DNA, Primer, Polymerase und Nucleotide werden zu einem PCR- Ansatz aufbereitet. 6. Gelelektrophorese erfolgt. 7. Individuelles Bandenmuster wird abgelesen (bzw. verglichen) 2nd cycle DNA-Stränge. 3. Elongation (Polymerisation): Auffüllen der fehlenden Stränge mit freien Nukleotiden...

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durch DNA- Polymerase (beginnt am 3`-Ende des angelagerten Primers und folgt dann dem DNA-Strang. Der Tochterstrang wird von 5`zu 3`aufgebaut. Der Primer wird nicht wieder abgelöst). Temperatur zwischen 68°C und 72°C. Mother Child 3rd cycle GAYMO 3. PCR wird durchgeführt. 4. PCR-Ansatz wird angefärbt und auf ein Agarosegel aufgetragen. 5. Marker-Cocktail, der angefärbte DNA-Fragmente bekannter Länge enthält, wird auf selbiges Agarosegel neben den zu analysierenden PCR-Ansätzen aufgetragen. Alleged Father nth cycle PCR product -2 copies Child and Alleged Father 1 Genübertragung mittels Vektoren Als Gentransfer bezeichnet man die Übertragung von einem oder mehreren Genen in eine Empfängerzelle. In der Molekularbiologie ist ein Vektor ein Transportvehikel, um eine DNA-Sequenz in eine Empfängerzelle einzubringen. Als Vektoren werden häufig Plasmide verwendet. Plasmide sind kleine, meistens ringförmige DNA- Moleküle, die vor allem in Bakterien vorkommen. Bakterien nutzen Plasmide natürlicherweise, um DNA- Sequenzen auszutauschen. In der Gentechnik können Plasmide aber auch zum Übertragen von DNA in pflanzliche, tierische und menschliche Zellen verwendet werden. Ziele: Herstellung von Medikamenten, Gentherapie, Veränderungen von Kulturpflanzen 1. Isolation Restriktionsenzyme schneiden z. B. ein bestimmtes Gen aus der menschlichen DNA. Jedes Restriktionsenzym setzt an einer bestimmten, mehrere Basen lange Erkennungssequenz an, die in beide Richtungen gleich gelesen wird. Da die Enzyme an beiden Strängen zwischen der zweiten und dritten Base ansetzen, bleibt jeweils ein Stück der Einzelstränge überstehen. Diese neigen dazu sich wieder zu verschließen (sticky ends). Die isolierten Plasmide werden mit dem gleichen Enzym wie die menschliche DNA bearbeitet, dabei ist es wichtig, dass es in dem Plasmid nur eine Erkennungssequenz für das Enzym gibt. 2. Rekombination Die sticky ends der geschnittenen menschlichen DNA verbinden sich mit denen des geschnittenen Plasmids. Die Lücken in den Zucker-Phosphat- Ketten werden von dem Enzym Ligase vernüpft. Jedoch entstehen dabei nur teilweise rekombinierte Plasmide, da sich die Plasmide auch wieder schließen können, ohne dass das Fremdgen eingefügt wurde. Dadurch erhält man ein Gemisch aus Plasmiden mit und ohne Fremdgen. Bakterien- chromosom Soliertes Plasmid Plasmid ohne Fremdgen Bakterium mit Plasmid Ohne Fremdgen ✓ werden während des 2weiten Schnittes ausgeschlossen Plasmid Bakterium rekombinantes Plasmid Baklenum mit Plasmid & Fremdgen werden durch Vergleichen der beiden Agarböder herausgefunder Anwendungen -menschliche Zelle DNA isoliertes Teilstück menschliche DNA Babtenum chne Plasmid Stirbt im ersten Selektionsschritt ab Isolation Rekombination Gentransfer Selektion 3. Gentransfer Die Plasmide dienen als Vektoren, um das Fremdgen in ein Bakterium zu transportieren. Dafür wird die Proteinbiomembran der Bakterien durchlässig gemacht, sodass sie die Plasmide einfach durch diese aufgenommen werden können. Dadurch entstehen Bakterienkulturen mit Plasmid und mit Fremdgen, mit Plasmid aber ohne Fremdgen und Bakterien ohne Plasmid. 4. Selektion Für die Selektion ist es erforderlich, dass auf den Vektoren zwei verschiedene Markergene liegen, meistens sind das zwei Antibiotikaresistenzen. Durch den Einbau der Fremd-DNA wird ein Markergen durchtrennt und ist dadurch nicht mehr synthetisierbar. Das hat zu Folge, dass nur Bakterien ohne Fremdgen gegen beide Antibiotika resistent sind, während die mit Fremdgen nur eine Resistenz besitzen. Mithilfe der Selektion kann man herausfinden, welche Bakterien Fremdgene haben. Zunächst werden dafür die Bakterien auf einen Agarboden mit dem Antibiotika gegeben, gegen das beide rekombinierte Bakterienarten immun sind. Die Bakterien, die kein Plasmid aufgenommen haben, sterben ab. Während des zweiten Selektionschrittes, werden die Bakterienkulturen auf einen zweiten Agarboden mit beiden Antibiotika übergestempelt. Dazu wird ein keimfreier Samtstempel verwendet. Die Bakterienkultur mit Fremdgen kann nicht mehr überleben. Die Muster der beider Agarböden werden verglichen, somit werden die Bakterienkulturen mit den Fremdgenen identifiziert. 5. Zellvermehrung Die Bakterienkultur mit Fremdgen kann gezüchtet werden und die Bakterien übernehmen damit Aufgaben wie z. B. die Insulinherstellung. 2

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Werkzeuge und Verfahrensschritte der Gentechnologie Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) Verfahren zur Vervielfältigung kurzer (genauer definierter Teile der) DNA-Basensequenzen in vitro (im Reagenzglas). Anwendung: Erkennung von Erbkrankheiten und Virusinfektionen, erstellen und überprüfen genetischer Fingerabdrücke, Klonieren von Genen, Vaterschaftstests Grundlegende Komponenten: Original-DNA, zwei Primer, DNA-Polymerase, Desoxynukleosidtriphosphate, Mg2+lonen, Pufferlösung, Thermocycler Ablauf der PCR: 25 bis 50 Zyklen in einem Thermocycler. Jeder Zyklus besteht aus drei Schritten: 1. Denaturierung (Schmelzen): Die doppelsträngige DNA wird auf ca. 95°C erhitzt, um die Stränge zu trennen. 2. Primer Hybridisierung (primer Annealing): Absenkung der Temperatur auf 50-65°C bewirkt Anlagerung der Primer an die einzelnen DNA template with sequence of interest 5' 3' dNTPs Primers Polymerase Denaturation 1st cycle 2 Annealing 3 Extension 5' Genetischer Fingerabdruck Im Verfahren des genetischen Fingerabdrucks benutzt man den Vergleich von besonders unterschiedlichen DNA- Bereichen, um einen Menschen zufällig zu identifizieren. Man analysiert kurze hintereinanderliegende Wiederholungssequenzen in den Basenpaaren der DNA, sog. Shorttandemrepeats (STRs). Die STRs können von zwei bis zu fünf Nucleotiden lang sein. Sie liegen direkt hintereinander und können sich unterschiedlich oft wiederholen. Die unterschiedlichen Längen und Wiederholungen der STRs sind für jeden individuell charakteristisch. Nach einer Vervielfältigung durch die PCR-Methode in einer Gelelektrophorese können diese bestimmt werden und das entstandene Bandenmuster ist dann der genetische Fingerabdruck. Anwendung: z.B. VaterschaftstestAblauf der Erstellung eines genetischen Fingerabdrucks: 1. DNA wird extrahiert (aus Speichel, Blut, Hautschuppen) 2. DNA, Primer, Polymerase und Nucleotide werden zu einem PCR- Ansatz aufbereitet. 6. Gelelektrophorese erfolgt. 7. Individuelles Bandenmuster wird abgelesen (bzw. verglichen) 2nd cycle DNA-Stränge. 3. Elongation (Polymerisation): Auffüllen der fehlenden Stränge mit freien Nukleotiden...

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