Q1.2 Gene und Gentechnik

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Hybridisierung und Detektion • Filter vom Gel getrennt + mit radioaktiv makierten Sonden (einzelsträngige DNA-Sequenzen, die bestimmten VNTR-Sequenzen entsprechen) inkubiert, die mit den fürs Verfahren wichtigen DNA- Sequenzen hybridisieren und somit markiert. • Überzählige Sonden durch Waschen entfernt und ein Rötgenfilm wird auf den Filter gelegt, der entwickelt wird und dann an den Stellen, an denen Sonden gebunden waren, schwarz gefärbt ist -> Autoradiografie 5. Ergebnis eines genetischen Fingerabdrucks Individuelles Muster von DNA-Fragmenten unterschiedlicher Länge aus schwarzen Balken. Die Anzahl und Größe der Fragmente hängen von den spezifischen Polymorphismen ab, die analysiert werden. Abgleich mit anderen Fingerabdrücken, um zu bestimmen, ob sie von derselben Person stammen oder nicht. Rastermutationen/Frameshiftmutationen Q1.2 Gene und Gentechnik 1. Insertion: • wenn ein oder mehrere Basenpaare in DNA-Sequenz eingefügt werden. Folgen: Störung der Leserichtung -> Fehlerhafte Proteinstruktur, Veränderung der Funktion des Proteins Beispiel: Cystische Fibrose ist eine Krankheit, die durch eine Insertion von drei Basenpaaren in der DNA-Sequenz des CFTR-Gens verursacht wird. 2. Deletion: • wenn ein oder mehrere Basenpaare aus der DNA-Sequenz gelöscht werden. Folgen: Störung der Leserichtung -> Fehlerhafte Proteinstruktur, Veränderung der Funktion des Proteins Beispiel: Die Huntington-Krankheit ist eine neurodegenerative Erkrankung, die durch eine Deletion von Basenpaaren in einem bestimmten Bereich des Huntingtin-Gens verursacht wird. Auswirkungen => Leserastermutation: • tritt auf, wenn eine Basenänderung zu einer Veränderung des Leserasters führt, was dazu führt, dass eine völlig andere Aminosäure in das Protein eingebaut wird. Dies kann zu einer Veränderung der Proteinstruktur und Funktion führen. Folgen: Veränderte Proteinstruktur, veränderte Funktion des Proteins, Erkrankungen wie z.B. Neurofibromatose. Beispiel: Die Neurofibromatose ist eine Erbkrankheit, die durch eine Leserastermutation im NF1-Gen verursacht wird. 2 Arten: In frame- Deletion: drei oder vielfaches von Basentripletts entfernt. Dadurch fehlen nur einzelne Aminosäuren und das Leserraster kann grundsätzlich erhalten bleiben. Out of frame- Deletion: hier werden keine gesamten Basentripletts entfernt. Es kommt zur Verschiebung des gesamten Leserasters hinter der Mutation (frameshift). Dadurch verändern sich die nachfolgenden Tripletts und codieren andere Aminosäuren. INSERTION: Met DELETION: Met Lys Lys Aicha A.H T DNA DNA mRNA Polypeptid mRNA Polypeptid Geltaschen ☐☐☐ 1 44 GP 40 Bp 36 Gp 32 Bp 30 Bp 27 Gp 25 Gp 24 Gp 21 Bp 20 Bp 18 Bp 15 Bp 12 Gp 5 Bp Massen- standards Agarose Gel Laufpuffer Gelkammer Probe (DNA o.Proteine) Person 1 Q1.2 Gene und Gentechnik Beladene Geltasche leere Geltasche Person 2 Täter U ■ 0 2 Kathode Banden Puffer Agarosegel Anode 01 FIT Aicha A.H 3 0 Q1.2 Gene und Gentechnik EVOLUTIONSASPEKT Auswirkungen von Genmutationen mit Folgen auf den Ebenen Phänotyp, Organismus [...] Genmutationen sind Treiber der Evolution und haben Auswirkungen auf den Phänotyp, den Organismus und die Variabilität in Populationen. Genpool: Organismen mit genetischer Variabilität im Bezug auf das vererbbare Merkmal Aicha A.H Evolutionsaspekt: • Genmutationen sind Veränderungen in der DNA, die die genetische Variabilität innerhalb einer Population erhöhen. -> Variabilität ermöglicht es Organismen, sich an veränderte Umweltbedingungen anzupassen und sich fortzupflanzen. ,,Survival of the fittest" -> die Lebewesen, die momentan besser Schlechter angepasste sterben Organismen, die besser angepasst sind, überleben. (Positive Anpassung) ngepasst sind, überleben. Sie Pflanzen sich fort => neue Genpools Veränderungen von Mutationen Phänotypische Auswirkungen: Genmutationen können das Aussehen eines Organismus beeinflussen Auswirkungen auf den Organismus: Genmutationen können auch Auswirkungen auf die Gesundheit und das Wohlbefinden eines Organismus haben, z.B. das Entstehen von Krankheiten oder Anfälligkeit für bestimmte Umweltbedingungen. Variabilität in Populationen: Genmutationen tragen dazu bei, die genetische Variabilität innerhalb einer Population zu erhöhen, was es Organismen ermöglicht, sich an veränderte Umweltbedingungen anzupassen. Antibiotikaresistenz: Genmutationen können dazu beitragen, dass Bakterien resistent gegen Antibiotika werden, was zu einer Herausforderung für die medizinische Behandlung darstellen kann. Mutationen und spezielle Anpassungen: Genmutationen können dazu beitragen, spezielle Anpassungen an bestimmte Umgebungen oder Lebensräume zu entwickeln, wie z.B. bei Fledermäusen, die eine besondere Fähigkeit entwickelt haben, mittels Echoortung zu navigieren. Q1.2 Gene und Gentechnik TRP-OPERON - ENDPRODUKTREPRESSION Bildung von aufbauenden Enzymen wird durch das Endpordukt des Stoffaufbauweges gehemmt. 1. Wenn Tryptophan vorhanden ist, bindet es an den Repressor und verändert seine Konformationsstruktur, so dass es nicht mehr an das Operator-Gen binden kann. (Inaktiver Repressor) 2. Ohne Repressor an das Operator-Gen gebunden, kann die RNA-Polymerase an die Promotor-Region binden und die Gene des Operons transkribieren-> Enzyme werden produziert, für die Synthese von Tryptophan 3. Dies ermöglicht dem Bakterium, Tryptophan zu synthetisieren (Endprodukt) und zu verwenden. 4. Das Endprodukt (Tryptophan) bindet nach seiner Produktion an den inaktiven Repressor und aktiviert ihn -> kann an den Operator binden -> Expression der Strukturgene wird verhindert 5. sinkt die Konzentration der Endprodukte in der Zelle dadurch -> Repressor geht wieder inaktiven Zustand -> neue Produktion von Endprodukten => Genexpression startet nur wenn die Genprodukte wirklich gebraucht werden. Repressor inaktiv => Enzymbildung => Überschuss an Endprodukt => Endprodukt bindet an Repressor => aktiver Repressor => unterbindet weitere Transkription DNA DNA DNA Regulatorgen R DNA Regulatorgen Regulatorgen Regulatorgen inaktiver Repressor Promotor Operator O inaktiver Repressor RNA- Polymerase P Substrat Promotor Operator O Aicha A.H Operator O Promotor Operator of S₁ S₁ Strukturgene S₂ S₁ ↓ mRNA mRNA₂ mRNA, 28 96 Enzym, Enzym₂ Enzym Strukturgene S₁ ↓ ↓ 1 mRNA mRNAZ mRNA, Į ↓ ↓ Strukturgene 25 53 Strukturgene ↓ mRNA₁ mRNA₂ ↓ ↓ 5₁. S3 ↓ mRNA3 ↓ Q1.2 Gene und Gentechnik Aicha A.H Genklonierung Verfahren, bei dem ein gewünschtes DNA-Fragment in einen Vektor wie ein Plasmid eingefügt wird. Der Vektor dient als Transportmittel, um Fremd-DNA in einen Wirt zu übertragen, z.B. Bakterienzelle. Die Genklonierung hat breite Anwendungsgebiete in Biotechnologie und biomedizinischer Forschung, wie der Produktion von Proteinen, Arzneimitteln und Impfstoffen, der Schaffung von Pflanzen mit verbesserten Eigenschaften sowie der Identifizierung von DNA-Spuren und der gezielten Genveränderung. PLASMIDE ALS VEKTOREN -mithilfe von Plasmiden lassen sich Vektoren (="Gentaxis") herstellen - Bakterien können bestimmte Gene exprimieren - Plasmide lassen sich leicht isolieren, können mit Fremdgenen ausge- stattet werden - Plasmid kann durch ori unabhängig vom Bakterienchromosom repli- ziert werden - Restriktionsenzyme ermöglichen den Einbau des Fremdgens; zur Iso- lation des Fremdgens wird dasselbe Enzyme verwendet → durch eine Zugabe von ONA-Ligase entsteht ein rekombinanter Vektor → Einbau gelingt nicht immer DNA-Isolierung/ Extraktion: • Um ausreichende Menge an DNA für weitere Verarbeitung zu erhalten, wird die gewünschte DNA-Probe aus dem Organismus extrahiert. Restriktion: • Nach DNA-Isolierung wird die DNA mithilfe von Restriktionsenzymen an spezifischen DNA- Sequenzen in kleinere Teile geschnitten, um sie in den Vektor einzufügen. Dabei entstehen "sticky ends", die die DNA einfach mit dem Vektor verbinden lassen. Ligation: • Nachdem die DNA geschnitten wurde, muss sie in das Plasmid (Vektor) eingefügt werden. Plasmid wird ebenfalls mit gleichen Restriktionsenzym geschnitten. • Fremd-DNA wird in das Plasmid integriert und die Ligase verbindet die "sticky ends" der DNA und des Vektors miteinander. Dieser Schritt führt zur Rekombination der DNA und des Vektors, wodurch eine rekombinante DNA (Insert) erhalten wird. Transformation: • rekombinante Plasmid wird nun in eine Wirtszelle, wie zum Beispiel E. coli, eingeführt, wo es repliziert und das eingefügte DNA-Fragment exprimiert wird. Hierbei muss die Zellwand der Bakterien durchlässig gemacht werden, um das Plasmid aufzunehmen, z. B. durch Elektroporation oder chemische Transformation. Die Regulation der Genaktivität bei Euykaryoten vor der Transkription: Methylierung • Methylierung bewirkt, das bestimmte Gene ,,stummgeschaltet" werden können und unsere Zellen gezielt steigern, welche Genprodukte sie benötigen und welche nicht. Dadurch kann dann keine Transkription stattfinden. • Die Methylierung ist eine Modifikation (Änderung der Struktur) und kann wieder rückgängig gemacht werden. • Q1.2 Gene und Gentechnik Wie wird Methylierung ausgeführt? natürliche Übertragung von Methylgruppen auf die DNA Basen Adenin und Cytosin mithilfe Methyltransferasen (DNMT) • Es entstehen dann die Basen Methyladenin und Methylcytosin, die wieder rückgängig gemacht werden können mithilfe Demethylasen. -> Demethylierung Wie beeinflusst Methylierung die Funktionalität von Genen? Schutzmechanismus ● Prokaryoten: DNA Methylierung als Schutzmechanismus zur Erkennung eigener und fremder DNA Methyltransferasen markieren Fremd- DNA (Methylierungsmjster) • Enzyme erkennen dieses Muster und zerschneiden die Fremde DNA • keine Zerstörung der eigenen DNA Aicha A.H Fehlerkorrektur • in der DNA Replikation Fehler • bestimmte Enzyme fahren neue DNA entlang, um Fehler zu erkennen + zu beheben (proof-reading) • Methylierung, um alte und neue Strang zu unterscheiden. Alte Strang methyliert Makierung Methylierung kann wie ein Textmarker zeigen, welche Stellen der DNA sie nutzen kann und welche nicht • trägt zum an und abschalten bestimmter Gene bei Bedarf (Genregulation) bei. • Proteine die für die Unterdrückung der Transkription zuständig sind an die Methylierten Stellen haften HISTON-METHYLIERUNG => Prinzip: Durch Methylierung können bestimmte Gene stummgeschaltet/deaktiviert oder aktiviert werden, um vor gravierenden Folgen zu schützen - nicht die Basensequenz, sondern die Verpackung der DNA wird verändert Methylgruppen werden an Histone angebracht DNA ist dadurch enger um die Histone gewickelt und die RNA-Polymerase blockiert - wird ebenfalls über Zellgenerationen weitergegeben Reversibel Q1.2 Gene und Gentechnik Die Regulation der Genaktivität bei Euykaryoten Durch diese Mechanismen kann das Ausdrucksmuster von Genen aktiviert oder deaktiviert werden, um den Bedarf der Zelle zu erfüllen. 1) Vor der Transkription: 1.a) DNA-Methylierung: Aicha A.H epigenetische Modifikation, bei der Methylgruppen an Cytosin-Basen in der DNA gebunden werden, um die Funktion von Transkriptionsfaktoren zu beeinflussen. Methylgruppen können die Bindung von Faktoren an die DNA verhindern oder einschränken, was dazu führen kann, dass bestimmte Gene deaktiviert werden. 1.b) Histonmodifikation und Chromatin-Remodeling: • Histone sind Proteine, die DNA umwickeln und zu Chromosomen formen. • Modifikationen wie Acetylierung, Phosphorylierung und Methylierung beeinflussen die Packung der DNA und somit auch die Transkription. Durch diese Modifikationen können Gene aktiviert oder deaktiviert werden, indem die Zugänglichkeit der DNA für Transkriptionsfaktoren verändert wird. 2) Während der Transkription: 2.a) Transkriptionsfaktoren: Dies sind Proteine, die an spezifische Sequenzen in der DNA binden und die Transkription regulieren. Sie steuern die Aktivität der Transkriptionsmaschinerie, indem sie bestimmte Gene aktivieren oder deaktivieren. Die Bindung kann durch epigenetische Markierungen wie Methylierung oder Histonmodifikation beeinflusst werden. 3) Nach der Transkription, aber vor der Translation: 3.a) Alternatives Spleißen: Dies ist ein Prozess, bei dem ein einziges RNA-Molekül in mehrere unterschiedliche RNA-Moleküle geteilt wird, was zu unterschiedlichen Proteinstrukturen und Funktionen führen kann. Durch alternatives Spleißen können aus einem einzigen Gen verschiedene Varianten von Proteinen produziert werden, die je nach Bedarf aktiviert oder deaktiviert werden können. 4) Während der Translation: 4.a) Mikro-RNAS und RNA-basierte Modifikationen: Während der Translation wird das RNA-Molekül in ein Protein übersetzt, und hier spielen mehrere Mechanismen eine Rolle bei der Beeinflussung der Übersetzung und Funktion des Proteins. Einer dieser Mechanismen sind Mikro-RNAS, kurze RNA-Moleküle, die regulierende Elemente in der Zelle sind. Sie regulieren das Ausdrucksmuster von Genen, indem sie direkt an die Messenger- RNA binden und so Übersetzung hemmen oder fördern. Darüber hinaus spielen auch RNA- basierte Modifikationen eine Rolle, bei denen bestimmte RNA-Moleküle durch Enzyme modifiziert werden, um ihre Funktion und Stabilität zu beeinflussen. 5) Nach der Translation: 5.a) Post-Translationale Modifikationen und Chromatin-Remodeling: Nach der Übersetzung kann das Protein durch post-translationale Modifikationen verändert werden, wodurch es seine Funktionalität und Aktivität beeinflusst wird. Dies kann durch Prozesse wie Phosphorylierung, Glykosylierung, Ubiquitinierung oder Acetylierung geschehen. Darüber hinaus kann auch das Chromatin-Remodeling eine Rolle spielen, bei dem Änderungen in der Packung von DNA und Histonen stattfinden, um die Transkription und Funktion von Genen zu beeinflussen Aicha A.H Die Regulation der Genaktivität bei Euykaryoten während der Transkription Der Prozess der Transkription wird durch eine Vielzahl von Regulatoren gesteuert, darunter Transkriptionsfaktoren (TF), positive und negative Regulatoren, Enhancer und Silencer sowie regulatorische DNA-Sequenzen. Transkriptionsfaktoren Transkriptionsfaktoren sind Proteine in eukaryotischen Zellen, die für das An- und Abschalten der Gene zuständig sind. Sie kontrollieren die Transkription während der Proteinbiosynthese und entscheiden welche Gene abgelesen werden. Q1.2 Gene und Gentechnik Allgemeine Transkriptionsfaktoren: greifen in der Initiationsphase der Transkription ein. in allen Zellen gleichmäßig vorhanden und wichtig, damit Transkription starten kann Es gibt zwar Promotoren die als Startregion fungieren, aber die RNA-Polymerase kann nicht eigenständig an die Startregion binden. => Erst möglich, nachdem sich verschiedene Transkriptionsfaktoren dort angesammelt haben und der Polymerase helfen den Promotor zu finden. • ● Im Detail: Der allgemeine Transkriptionsfaktor TFIID bindet an die sogenannte TATA-Box.(Region auf dem Promotor mit viel Adenin und Thymin). Diese Bindung sorgt für eine Änderung der Struktur des Proteins und der DNA. -> Es bilden sich neue ,,Andockstellen" für weitere allgemeine Transkriptionsfaktoren => es ensteht ein Transkriptionskomplex (6). Erst dann kann die RNA Polymerase II mit den Transkriptionsfaktoren an den Promotor docken. Spezifische Transkriptionsfaktoren tragen zur Spezialisierung eukaryotischer Zellen während ihrer Entwicklung bei, denn in allen Zellen sind alle Gene vorhanden, aber es wird dadurch beeinflusst welche Genprodukte wann und in welcher Menge hergestellt werden · • nur in bestimmten Zelltypen vorhanden, in denen sie ein spezielles Gen aktivieren oder unterdrücken sollen. ● Bsp.: binden an bestimmte DNA-Abschnitte und können durch eine Wechselwirkung mit der RNA-Polymerase die Geschwindigkeit der Transkription (Transkriptionsrate) regulieren. • manche Abschnitte sind positive Regulatoren (= Erhöhen die Geschwindigkeit) => Enhancer an die Aktivatorproteine binden können • andere sind negative Regulatoren (= verringern die Geschwindigkeit) => Silencer an die Repressorproteine „docken" können => weil Enhancer und Silencer weit entfernt von der zu übersetzenden Basensequenz liegen, bildet sich eine Art Schlaufe in der DNA, um eine Wechselwirkung mit dem RNA- Polymerase-Komplex zu ermöglichen. Q1.2 Gene und Gentechnik Aicha A.H Q1.2 Gene und Gentechnik E. coli - das Haustier der Gentechniker E. coli ist ein weit verbreitetes Bakterium und aufgrund seiner einfachen Handhabung und schnellen Vermehrung eine beliebte Wahl in der Gentechnik. Die Eigenschaften von E. coli, die es zu einem "Haustier" der Gentechniker machen, sind: Einfache Handhabung: lässt sich leicht kultivieren und wächst unter einfachen Bedingungen wie einem Nährmedium und einer Temperatur von 37°C. • Schnelle Vermehrung: kurze Generationszeit von etwa 20 Minuten; idealen Organismus für die Vermehrung von DNA Aicha A.H • Kleine Größe: E. coli ist ein kleines Bakterium, was es einfacher macht, es in großen Mengen zu kultivieren und zu manipulieren. • Bekannte Genomsequenz: Das Genom von E. coli ist vollständig sequenziert und bekannt • Verbreitung in der Natur: E. coli ist ein natürlich vorkommendes Bakterium im menschlichen Darm und in vielen anderen Umgebungen. Restriktionsenzyme: spezialisierte Endonukleasen, die spezifische DNA-Sequenzen erkennen und durch Hydrolyse der Phosphodiester-Bindungen schneiden können. Diese Enzyme werden aus Bakterien isoliert/ gewonnen, um in der Gentecknik genutzt zu werden. Substratspezifität: • Restriktionsenzyme sind in der Lage, DNA-Sequenzen äußerst präzise zu erkennen. • Sie binden an bestimmte Erkennungssequenzen, in der DNA, die typischerweise 4-6 Basenpaare lang sind und die in beiden Strängen ein Palindrom bilden, das heißt in beide Richtungen gleich gelesen werden, in 5'-3' Richtung • Sobald das Enzym an der Restriktionsstelle gebunden ist, kann es die Phosphodiester- Bindungen in der DNA hydrolysieren und dadurch die DNA schneiden. Wirkungsspezifität: • Restriktionsenzyme trennen durch Hydrolyse die Basenpaare auf, indem sie die Zucker-Phosphat-Bindungen in beiden DNA-Strängen spalten. Es gibt zwei Arten von Schnitten: Blunt Ends: • Restriktionsenzyme vollziehen einen glatten Schnitt durch die DNA, ohne dass an den Schnittstellen Einzelstrang-DNA übersteht. (geradlinig und schwieriger zu bearbeiten) Sticky Ends: • Der Schnitt erfolgt in beiden Strängen versetzt zwischen den Basen, sodass an den Schnittstellen ein kurzes Stück Einzelstrang-DNA übersteht. • Diese klebrigen Enden sind in der biotechnologischen Forschung nützlicher. GG CC CC GG GAATTC CTTAA G Eco RI Haelll TCAA AGC T Taq! beim ersten Opfer sichergestellte DNA-Spuren Größenvergleichs- standard Gewicht Vervielfältigung der DNA mittels PCR und Zugabe von Restriktionsenzymen Papiertücher Nitrozellulose- filter Gel Q1.2 Gene und Gentechnik Schwamm Pufferlösung beim zweiten Opfer sichergestellte DNA-Spuren Gelelektrophorese + 7 + |Q||||||||||||| DNA-Denaturierung und Blotting Waschen zum Entfernen überzähliger Sonden DNA-Probe des Verdächtigten Auflegen eines Röntgenfilms auf den Filter Entwicklung des Röntgenfilms DNA-Fragmente Nitrozellulosefilter wird vom Gel abgezogen. Inkubation mit radioaktiver Sonde man sucht nach spezifischen Sequen radio- aktive Sonde Plastik- beutel Aicha A.H Selektion von rekombinanten Zellen: • Um sicherzustellen, dass nur transformierte Zellen, die sowohl das DNA-Fragment als auch das Markergen enthalten, weiterkultiviert werden, werden sie vorher mit Antibiotika (Ampicillin, Tetracylin) behandelt.-> Reportergene bzw. Resistenzgene: 2.Möglichkeiten: 1) 2 Antibiotika-Resistenz-Gen: z.B: ampR, tetR 2) 1 Antibiotika-Resistenz-Gen + lacZ-Gen => blau-weiß-Selektion • Die transformierten Zellen, die das Antibiotikum-Resistenzgen auf dem Vektor besitzen, überleben und können weiter vermehrt werden. Dadurch wird sichergestellt, dass nur die Zellen weiterkultiviert werden, die das gewünschte DNA-Fragment enthalten. Alternativ kann auch eine Blau-Weiß-Selektion durchgeführt werden. 3 Ergebnisse: Zelle mit Plasmid und Fremd-Gen (erfolgreich) Hypothetische Bakterien: Kein Q1.2 Gene und Gentechnik rekombinantes Gen Zelle mit Plasmid ohne Fremd-Gen (nicht erfolgreich) Zelle ohne Plasmid und Fremd-Gen (nicht erfolgreich) TRANSFORMATION ERFOLGLOS ohne Plasmid und Fremd-Gen (nicht erfolgreich) teta -ampa Wunsch- gen ERFOLGREICHE TRANSFORMATION MIT REKOMBINANTEM PLASMID Zelle mit Plasmid und Fremd-Gen (erfolgreich) tefa -ampR ERFOLGREICHE TRANSFORMATION OHNE REKOMB. PLASMID Mit Plasmid ohne Fremd-Gen (nicht erfolgreich) Aicha A.H tetr - lacz Gereinigte Vektoren: Nach der Vermehrung der rekombinanten Zellen werden die Vektoren isoliert und gereinigt, um das gewünschte DNA-Fragment und das Markergen zu erhalten. Hierfür können Methoden wie Zentrifugation, Chromatographie oder Filtration eingesetzt werden. Anwendung: Nach erfolgreicher Überprüfung des Klonierungserfolgs kann das geklonte Gen für verschiedene Anwendungen eingesetzt werden. • Beispiele hierfür sind die Untersuchung der Genfunktionen in einem bestimmten Organismus, die Durchführung von gentechnischen Modifikationen zur Verbesserung oder Änderung von Eigenschaften in einem bestimmten Organismus, die Produktion von Biopharmazeutika wie Insulin oder Antikörpern sowie die Erzeugung von Hybridpflanzen mit gewünschten Eigenschaften wie höherer Widerstandsfähigkeit gegen Krankheiten oder Umweltbedingungen. ANTIBIOTIKA-RESISTENZGENE 1. Kolonien mit Plasmiden Kolonien mit Plasmiden ohne Fremdgene ONA- Ligase Fremdgen (eerstmed amp". Vergleich der Muster das Promotor (Startpunkt DNA- Folymerase 2. deaktiviertes Lacz-Gen ori (Reputationsstart) puc 18 Plasmid Gewünschte Kolonie mit rekombinantem Plasmid Nährboden mit Tetracyclin 3. 2.Selektionsschritt -> Überprüfung: ob ein Plasmid mit dem Fremdgen aufgenommen wurde - überträgt Bakterienkolonien mit Samtstempel in schale mit Ampicilin (Replikaplattierung) -> es verbleiben Bakterien auf der ersten Petrischale - nur Bakterien überleben, die ein Plasmid ohne Fremdgen eingebaut haben -> Bakterien mit dem Fremdgen sterben ab, weil das ampR-Gen durch das Fremdgen zerschnitten ist Nährboden mit Ampicillin ampR- Gen Q1.2 Gene und Gentechnik 1 1.Selektionsschritt -Überprüfung, ob ein Plasmid aufgenommen wurde - kultiviert die Bakterien auf Nährboden mit Antibiotikum Tetracyclin -> alle Bakterien ohne Plasmid werden durch Tetracyclin abgetötet, weil sie das Resistenagen tetR nicht besitzen Übertragung der Kolonien mit einem Samtstempel Aicha A.H 3.Schritt: Auswertung - Vergleich der beiden Petrischalen: -> Kolonien, die in der ersten Schale vorhanden sind in der zweiten nicht, sind die gewünschten Kolonien mit rekombinanten Plasmid => Kolonien mit dem rekombinanten Plasmid können identifiziert werden BLAU-WEISS-SELEKTION 2 4.Vermehrung der Kolonien mit Vektoren-> zahlreiche Kopien eines Fremdgens entstehen=> ,,Gen- Klonierung" nun selektiert werden Kolonien mit Plasmidan ohne Fremdgan gewünschte Kolonien mit rekombinantem Plasmid Nährboden mit Ampicilin & X-Gal 1. SCHRITT alle Bakterien werden auf einem Nährboden mit Ampicilin (Antibiotikum) & X-Gal(Zucker) kultiviert, wodurch die falschen Bakterien sterben oder einfärben 2.Schritt: -Bakterien mit Plasmid, ohne Fremdgen überleben wegen des ampR-Gens & die Kolonie setzt blauen Farbstoff frei -Bakterien mit Plasmid, mit Fremdgen überleben wegen des ampR-Gens & die Kolonie setzt keinen blauen Farbstoff frei -> gewünschten rekombinanten Bakterien bleiben weiß - Bakterien mit dem Plasmid & einem zerschnittenen Lacz-Gen,ohne Fremdgen sterben, da das Resistenzen nicht vorhanden oder abgelesen werden kann. 14 Wattestäbchen mit Zellen von Mundschleimhaut PCR KLONIERUNG Am Beispiel von Insulin Gen mit Antibiotika- resistenz Gesamt- DNA Insulin-Gen RESTRIKTIONS- VERDAU LIGATION TRANSFORMATION SELEKTION III überhängende Enden Plasmid Manche Bakterien besitzen chromosomale DNA und ringförmige Plasmid-DNA Bakterien mit Plasmid Fermenter PLASMID- ISOLATION Restriktionsenzyme schneiden die DNA 2000 Volt Gen mit Antibiotika- resistenz Das Enzym Ligase verknüpft die über- hängenden Enden *wurde im Voraus ins Plasmid kloniert Bakterium ohne Plasmid Nicht alle Bakterien nehmen das Plasmid auf Das Antibiotikum tötet die Bakterien, die kein Plasmid aufgenommen haben Insulin- Proteohormon 42°C PROTEINISOLATION Hier werden die Bakterien in grossem Stil aufgezogen Aicha A.H Q1.2 Gene und Gentechnik Aufbau von Prokaryoten: Q1.2 Gene und Gentechnik Bau und Vermehrung von Bakterien Def.: Bakterien, die zu den Prokaryoten gehören, sind einzellige Mikroorganismen ohne eine eindeutige Zellstruktur. Sie haben keinen Kern und ihre DNA befindet sich in einem zentralen Bereich. Prokaryotische Bakterien sind weit verbreitet und kommen in einer Vielzahl von Umgebungen vor, einschließlich Boden, Wasser und menschlichen Körpern C 1. Schleimkapsel: Schleimschicht umgibt die Zelle; dient als Schutz 2. Zellwand: Zellwand aus Murein (Peptidoglykan); gibt der Zelle Form, Schutz 3. Speicherstoff: Lipidtropfen können als Speicher für Fette und Energie dienen. 4. Zellmembran: Zellmembran bildet äußere Begrenzung der Zelle ;reguliert Stoffaustausch. 5. Mesosom bzw. Membranausstülpung: für Stoffwechsel, die Energieproduktion und die DNA-Replikation. 6. Cytoplasma: Inhalt der Zelle welches aus Wasser, Salzen und Proteinen besteht. 7. Plasmid: kleine ringförmige DNA, die unabhängig vom Bakterienchromosom repliziert wird und oft Gene für Antibiotikaresistenz enthält. 8. Ringförmige DNA (Bakterienchromosom): Bakterien-DNA ist in einem einzigen, ringförmigen Chromosom organisiert, das die meisten Gene für die Zellfunktionen enthält. 9. Ribosomen (70s): Proteinfabriken der Zelle; sind für die Proteinbiosynthese verantwortlich. 10. Flagellum (Geißel): lange, dünne Struktur; Fortbewegung der Zelle Aicha A.H Schleimkapsel Zellwand Vesikel (Speicherstoff) Zellmembran Mesosom Cytoplasma Plasmid Bakterienchromosom (ringförmige DNA) Ribosomen (70S) Flagellum (Geißel) Binary Fission bei Bakterien: Vorbereitung: Bevor die Teilung beginnt, nimmt das Bakterium an Größe zu und verdoppelt seine DNA. Zellmembran: Die Zellmembran beginnt sich zu spalten und zu dehnen, um zwei separate Zellen zu bilden. Zentrosom: Ein Organell im Inneren des Bakteriums, das Zentrosom, beginnt Mikrotubuli auszusenden, um den Teilungsprozess zu steuern. Ringbildung: Die Mikrotubuli bilden einen Ring, der sich ausdehnt und die Zelle in der Mitte Q1.2 Gene und Gentechnik teilt. Zellenkern: Der Zellenkern beginnt sich zu teilen und jede Zelle erhält eine Kopie der DNA. Abschluss: Sobald die Teilung beendet ist, trennen sich die beiden neuen Zellen und jede von ihnen wächst und vermehrt sich unabhängig. Reproduktion: Dieser Prozess wird fortgesetzt, bis eine bestimmte Anzahl von Bakterien erreicht ist. Anschließend können sie sich weiter vermehren, indem sie ihre DNA duplizieren oder auf andere Weise kopieren. A Zusammenfassend ist die binary fission ein schneller und einfacher Reproduktionsprozess, der es Bakterien ermöglicht, sich schnell zu vermehren und ihre Population zu erhöhen. Neue Polzelle Alter Zellpol Pol 2 0 0 1 0 1-Pol Zellwachstum 0 0 2 Neue Zellpole Neuer Pol in den nächsten zwei Teilungen Beginn der Zellteilung Aicha A.H Alte Polzelle 1 0 0 3 B Alter Zellpol Alter Pol in den nächsten zwei Teilungen Q1.2 Gene und Gentechnik . Gelelektrophorese Die Gel-Elektrophorese ist eine Standardmethode zur Trennung von Nukleinsäuren und Proteinen sowie zur Analyse von DNA. Sie wird in einer Vielzahl von Anwendungen eingesetzt, darunter: Kriminalistik (Tätersuche) Vaterschaftsnachweise Lebensmittelanalytik Humangenetik (Ermittlung von Erbgängen) Aicha A.H Was ist Gel-Elektrophorese? Gel-Elektrophorese ist eine Methode zur Trennung von Nukleinsäuren und Proteinen, zur Analyse von DNA. Anwendung: Kriminalistik (Tätersuche), Vaterschaftsnachweise, Lebensmittelanalytik und Humangenetik (Ermittlung von Erbgängen). Ablauf der Gelelektrophorese: 1.Sammlung von DNA: Fremd-DNA wird vom Tatort gesammelt und DNA wird von jedem Verdächtigen entnommen. Vervielfältigung von DNA: Die VNTR-Region jeder DNA muss mithilfe der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) vervielfältigt werden. Schneiden der DNA: Die DNA-Abschnitte werden durch den Einsatz von Restriktionsenzymen in unterschiedlich große Fragmente geschnitten. Übertragung in Gel-Taschen: Die negativ geladenen DNA-Fragmente werden in Gel-Taschen eingefüllt. 2. Gel-Elektrophorese: Eine Agarose-Gel-Lösung wird in eine Elektrophoresekammer mit einer Pufferlösung (Laufpuffer) gelegt, die sich zwischen den Elektroden befindet. Die beiden Elektroden (Anode und Kathode) werden an den Strom angeschlossen, was zu einer elektrischen Spannung führt. Diese Spannung bewirkt, dass sich die negativ geladenen DNA-Moleküle in Richtung der positiv geladenen Anode bewegen. 3. Sichtbarmachung der DNA-Banden: Sobald die DNA-Moleküle das Ende des Gels erreicht haben, bilden sich unsichtbare Banden, in denen sich jeweils gleich lange DNA-Moleküle befinden. Um diese Banden sichtbar zu machen, wird das Gel durch Färbetechniken (z. B. mit Ethidiumbromid) gefärbt. Auswertung: Vergleich des DNA-Bandenmusters mit einem Längenstandard (restringierte DNA), dessen Fragmentgröße bekannt ist. Eine Übereinstimmung des DNA-Banden musters zwischen Tatort und Verdächtigem weist darauf hin, dass der Verdächtige die gleiche DNA besitzt wie die am Tatort gefundene DNA. Gentransfer bei Bakterien Transformation, Konjugation und Transduktion sind drei verschiedene Mechanismen des horizontalen Gentransfers bei Bakterien, die es Bakterien ermöglichen, ihre genetische Information an andere Bakterien weiterzugeben. Transformation: Prozess, bei dem freie DNA von einer Zelle in eine andere eindringt und in ihr Genom integriert wird. -> kann dazu beitragen, dass sie neue Eigenschaften erwerben oder ihre Evolution beschleunigen. -> freie DNA kann zum Beispiel in ein anderes Bakterium eingeschleust werden. Dabei nimmt das Bakterium die freie DNA auf Integriert diese in sein Genom -> Bakterium erwirbt neue neue Eigenschaften, da die genetische Information verändert wird KONJUGATION Empfänger- Spender- zelle zelle JQ-08-09-08 Konjugation: 1) Spenderzelle baut zuerst über Sex-Pilus Kontakt zu Empfängerzelle auf 2) Plasmabrücke zur Empfängerzelle aufgebaut, über die genetisches Material übertragen werden kann 3) über Plasmabrücke wird ein Einzelstrang des Plasmids (F-Plasmids) der Spenderzelle zur Empfängerzelle gebracht 4) Plasmabrücke löst sich auf; Einzelstränge in beiden Zellen zu Doppelstrang synthetisiert TRANSDUKTION Bakteriophage Wirtszelle 4 1 crossing over ↑ Phagen-DNA T A Plasmid Wirtschromo- som 8 neue Wirts- selle Q1.2 Gene und Gentechnik 1 3 rekombinantes Bakterium Plasma- brücke 2 2 Aicha A.H TRANSFORMATION Spender- zelle 3 5 freie DNA Empfänger- zelle Transduktion 1). Bakteriophage (Virus) heftet sich an Wirtszellle • Injektion der Phagen-DNA in Bakterienzelle 2) • Chromosom des Wirtes wird in zahlreiche DNA- Fragmente zerlegt 3) bei Phagenreifung kann ein Stück der Wirts-DNA in das Kopfteil der Phage gelangen -> Phage ist defekt, kann jedoch ein anderes Bakterium infizieren • neu zusammengesetzten Phagen verlassen Wirtszelle • „alte" Wirtszelle wird zerstört/lysiert 4) ,,defekte" Phage kann ein anderes Bakterium infizieren und die Bakterien-DNA injizieren DNA-Fragment kann durch Crossing-Over Ereignisse in die DNA der neuen Wirtszelle eingebaut werden => rekombinantes Bakterium entstanden ! TFIE Gen RNA- Polymerase TFIIB Silencer Transkriptionsrichtung 84.1 Eukaryotische Transkription Q1.2 Gene und Gentechnik TATA-Box Initiator- TATA-Box Region TFIIF TFIH -TFIID Enhancer TFIJ DNA TFIIA stromaufwärts E H Mediator RNA-Poly- merase II Enhancer v 2 Transkriptionsrichtung Transkription Enhancer Aicha A.H 6 Silencer DNA DNA spezifischer Transkriptionsfaktor Transkriptionsfaktor isolatorbindendes Protein stromaufwärts 84.2 Enhancer-Mediator-RNA-Polymerase-Komplex ABLAUF [In-vitro] ZIEL: Vervielfältigung von DNA-Fragmenten (auch geringste genetische Spuren) => Medizin, Kriminalistik, Vaterschaftstests... ONA Vorlage 6 5' Q1.2 Gene und Gentechnik POLYMERASE-KETTEN-REAKTION (PCR) Aicha A.H NUNUNUN ОПЛЮЮ A 5' 5' NUNUNUN 1 3' ДМЮЧЮНЬ. 1 freie Nucleotide 5 TUNUNUNU ANON Ĵ DNA- Primer 2 TUNT IMOUOMAL 3' 5' NUNUNUNU LOCUL 3 3 taq-Polymerase TAULUT O 5' 5' NUNUNUAT ¹Ð¶ÎÑÒÌ‚ÏÏÔÏ TUTULU ДИПЛОМИНЬ Sg NUNUNUNU 1200 TUUUUU ДИПЛОЧИСЬ Materialien: Thermocycler, DNA-Fragment, 2 verschiedene DNA-Primer typen, freie DNA- Nucleotide (dntps), hitzebeständige Polymerase (z.B:taq-Polymarase) 1. Schritt: DENAUTURIERUNG - Erhitzen auf ca. 94°C - Wasserstoffbrückenbindungen im DNA-Strang durch Hitze aufgebrochen => dadurch spaltet sich der DNA- Doppelstrang in zwei Einzelstränge (dienen als Matrizen) 2.Schritt: PRIMERHYBRIDISIERUNG Abkühlen auf etwa 60°C - 2 DNA-Primer lagern/binden sich über Wbb an ihre komplementären Sequenzen an das 3´- Ende des Ausgangs-DNA-Fragments - Da es 2 unterschiedliche Primer gibt -> kann man Anfang und Ende der Sequenz festlegen 3.Schritt: VERLÄGERUNG/AMPLIFIKATION - Temperatur auf 72°C erhöht - Polymerase (taq-Polymerase) ergänzt vom jeweils 3'Ende der beiden Primer ausgehend mithilfe im Ansatz vorhandenen Nukleotide, die vorliegenden Einzelstränge zu Doppelsträngen - Dieser Prozess wird 20-30 mal wiederholt, was zu einer exponentiellen Vervielfältigung des DNA- Fragmentes führt => Am Ende der Reaktion kann es bis zu 2^30 DNA-Fragmente geben. Während der ersten Runden kann es jedoch vorkommen, dass zu lange komplementäre Stränge synthetisiert werden. Dies ist darauf zurückzuführen, dass bei der Synthese von den Primern ausgehend in 5'-3'-Richtung kein Stopp-Signal am Ende des DNA-Abschnitts vorliegt. Im weiteren Verlauf dienen diese zu langen Stränge jedoch selbst als Vorlage für die Synthese. Die neu synthetisierten Stränge sind durch den Primer und das Ende der Vorlage begrenzt und besitzen die Länge des zu vervielfältigenden DNA-Abschnitts. REGULATION DER GENAKTIVITÄT Operonmodell/Jacob-Monod-Modell (Schema) am Beispiel des Lac-Operons bei Prokaryoten Das Operon-Modell allgemein: Das Operon-Modell beschreibt die Regulation der Genexpression in Bakterien. Es erklärt wie bei Bakterien, Gene an und abgeschaltet (reguliert) werden können, um die Produktion von Proteinen an die Umweltbedingungen anzupassen und Energie zu sparen. . Q1.2 Gene und Gentechnik Operon: ein DNA-Abschnitt, der einen Promotor, Operator und Strukturgene enthält. Das Operon wird von einem Regulatorgen in einer benachbarten DNA-Region gesteuert. • Promotor: Ansatz & Startpunkt für die RNA-Polymerase, an dem sie beginnt, die Gene des Operons zu transkribieren Operator: Andockstelle des Repressors, um die Transkription der Gene zu hemmen oder zu aktivieren DNA Strukturgene: enthalten genetische Infos zur Bildung der Enzyme. Regulatorgene: Gene, die Produkte codieren, die als regulierende Proteine fungieren und die Transkription der Strukturgene des Operons beeinflussen. Repressor: Genprodukt des Regulatorgens, bindet an den Operator RNA- Polymerase Regulatorgen R mRNA Aicha A.H Promotor Operator aktiver Repressor S₁ Strukturgene S₂ S3 Q1.2 Gene und Gentechnik Anwendungen von Restriktionsenzymen in der Gentechnik: Aicha A.H Klonierung von DNA-Sequenzen: Restriktionsenzyme können gezielt DNA-Sequenzen schneiden, um die Herstellung von eigenen DNA- Sequenzen zu ermöglichen. Herstellung von Medikamenten: Restriktionsenzyme werden verwendet, um Plasmide zu schneiden und zu bearbeiten, was für die Herstellung von Medikamenten in Bakterienzellen von Bedeutung ist. Anwendung in forensischen Untersuchungen: Restriktionsenzyme werden auch in Paternity-Tests und genetischen Fingerabdrücken verwendet. Durch das Schneiden der DNA mit Restriktionsenzymen können einzigartige Muster von DNA-Fragmenten erzeugt werden, die als genetischer Fingerabdruck dienen können. Analyse von DNA-Fragmenten: Die DNA-Fragmente, die beim Verdau durch Restriktionsenzyme entstehen, werden mithilfe der Gel- Elektrophorese nach Größe aufgetrennt. Metylierung: Das Methylierungssystem ist ein von Bakterien genutztes System zum Schutz ihrer eigenen DNA vor Restriktionsenzymen. Durch die Methylierung können Bakterien zwischen eigener und fremder DNA unterscheiden. Methyltransferasen fügen Methylgruppen an spezifische Basen wie Adenin oder Cytosin der DNA-Sequenz an. Restriktionsenzyme, die in das Bakterium eindringen, können die markierte eigene DNA erkennen und nicht schneiden, da die Methylierung die Bindungsstellen der Enzyme blockiert. Q1.2 Gene und Gentechnik LAC-OPERON SUBSTRATINDUKTION: Operon, das die Produktion von Enzymen, die für die Verdauung von Laktose verantwortlich sind, reguliert. Substrat sorgt für die Synthese von Enzymen, die für seinen eigenen Abbau zuständig sind. Wenn kein Substrat (Laktose) vorhanden: 1. Repressor, ist aktiv und bindet an Operator 2. Da Repressor an Operator-Gen gebunden ist, kann RNA- Polymerase nicht an Promotor-Region binden -> keine Transkription der Strukturgene des Operons -> keine Enzymbildung, für Abbau von Laktose. => kein Substrat vorhanden = keine Enzyme, die das Substrat abbauen könnten Wenn Substrat (Laktose) anwesend ist, ändert sich die Situation: 1. Nimmt das Bakterium das Substrat (Laktose) als Nahrung auf, bindet Substrat an Repressor und inaktiviert ihn -> Repressor kann nicht mehr an das Operator-Gen binden. (Inaktiver Repressor) 2. RNA-Polymerase kann an die Promotor-Region binden und die Struktur Gene des Operons in mRNA transkribieren. -> Enzyme werden produziert, die für die Abbau von Laktose erforderlich sind. => Substrat= Enzyme werden hergestellt, die das Substrat verdauen. 5. Alles Substrat abgebaut -> Repressor wieder aktive Form -> Transkription der Strukturgene gestoppt. DNA DNA DNA Regulatorgen R RNA- Polymerase Regulatorgen STARK Regulatorgen R Regulatorgen Substrat Aicha A.H Promotor Operator aktiver Repressor Promotor Operator inaktiver Repressor Promotor Operator 0 inaktiver Repressor Promotor Operator S₁ Strukturgene Sz ↓ mRNA; my Enzymy Enzyn S₁ S₁ ↓ mRNA Strukturgene mRNA ↓ de 98 dhe Enzym, Enzym₂ Enzym mRNA₂ mRNA ↓ Strukturgene S3 ↓ ↓ mRNA₂ mRNA, ↓ Strukturgene Genmutationen Punktmutationen Q1.2 Gene und Gentechnik Genmutationen sind dauerhafte Veränderungen in der DNA-Sequenz eines Gens, die zu einer veränderten oder abweichenden Funktion des betroffenen Gens führen können. Genmutationen können spontan auftreten oder durch mutagenen Substanzen wie bestimmten Chemikalien, radioaktive Strahlung, Temperaturen verursacht werden. Met AGGG Gly Auswirkung => DNA mRNA STOPP Polypeptid 1. Duplikation: • Duplikation entsteht, wenn Teil der DNA-Sequenz verdoppelt wird. -> kann zu Überproduktion eines bestimmten Proteins führen, was Funktionsstörungen und Erkrankungen zur Folge haben kann. Beispiel: Muskeldystrophie ist eine genetische Erkrankung, die durch eine Duplikation eines Abschnitts des Dystrophin-Gens verursacht wird. 2. Substitution: • Substitution tritt auf, wenn eine Basensequenz durch eine andere ersetzt wird. -> kann zu einer Veränderung der Struktur und Funktion des Proteins führen. Stille Mutation: • tritt auf, wenn eine Basenänderung zu keiner Veränderung in der Proteinstruktur und Funktion führt. Codon, codiert für die selbe Aminosäure. Normale Sequenz Beispiel: Die sickle cell anemia ist eine Bluterkrankung, die durch eine Substitution einer Basensequenz im HBB-Gen verursacht wird. Folgen: Keine sichtbaren Folgen, aber die Mutation kann als "genetischer Marker" verwendet werden, um bestimmte Populationen zu verfolgen. Missense-Mutation: • tritt auf, wenn eine Basenänderung zu einer Veränderung einer Aminosäure im Protein führt. Dies kann zu Veränderung der Proteinstruktur und Funktion führen. Es entsteht ein Codon, das für eine andere Aminosäure codiert. Beispiel: Marfan-Syndrom ist eine Erbkrankheit, die durch eine missense- Mutation im Fibrillin-1-Gen verursacht wird. Nonsense-Mutation: • Basenänderung führt zu einem Stopp-Codon und Proteinsynthese wird frühzeitig gestoppt. Codon, welches für einen Stoppcodon codiert. Kann zu einem Funktionsverlust des Proteins führen Aicha A.H Beispiel: Die Tay-Sachs-Krankheit ist eine seltene Erbkrankheit, die durch eine Nonsense-Mutation im HEXA-Gen verursacht wird und zu einem Funktionsverlust des Enzyms Hexosaminidase A führt, und schließlich zum Tod führt STUMME MUTATION: Met Met MISSENSE-MUTATION: Lys Met Lys NONSENSE-MUTATION: Gly DNA mRNA Polypeptid DNA mRNA STOPE Polypeptid DNA mRNA Polypeptid Herstellung eines transgenen Bakteriums Plasmid mit Ampicillin-Resistenz-Gen und B-Galaktosidase-Gen Ein Plasmid mit zwei Marker-Genen (AmpR- Gen; B-Gal-Gen) wird isoliert und mit einem geeigneten Restriktions- enzym geschnitten Bakterium ohne Plasmid GENTECHNISCHE HERSTELLUNG VON HUMANINSULIN - EINE GESAMTÜBERSICHT - blaue Bakterien -Kolonien bebrütete Petrischale Q1.2 Gene und Gentechnik 90⁰ Das Humaninsulin-Gen wird isoliert und mit dem entsprechenden Restriktionsenzym geschnitten. Es enthält nun die gleichen sticky-ends wie das geschnittene Plasmid. geschnittenes Plasmid Bakterium mit nicht- rekom- biniertem Plasmid weiße Bakterien- Kolonien sticky-ends 90⁰ C aufnahmeberejte Bakterien Bakterium mit rekom- biniertem Plasmid Petrischale mit ampicillinhaltigem Nährboden rekombiniertes Plasmid go⁰ Bakterien, die ein Plasmid aufgenommen haben wachsen auf den Platten. Es zeigen sich weiße und blaue Kolonien. Blaue Kolonien haben zwar ein Plasmid aufgenommen, verfügen aber über ein intaktes B-Galaktosidase-Gen. Weiße Kolonien haben Plasmide aufgenommen, die das Humaninsulin enthalten. 90⁰ Aicha A.H Humaninsulin-Gen Die Suspensionen mit geschnittenem Plasmid und dem Humaninsulin-Gen werden gemischt und inkubiert. Nun wird das Enzym Ligase zugefügt. Diese Suspension wird mit aufnahmebereiten Bakterien zusammengegeben. In einigen Fällen findet Transformation statt Die Suspension wird auf ampicillinhaltige Nährböden, die den Zucker X-Gal enthalten, ausplattiert und im Brutschrank inkubiert. Isolieren der weißen Kolonien und Vermehrung der Bakterien in größeren Kulturen Anzucht der rekombinierten Bakterien in einem größeren Maßstab (Fermenter) VERMEHRUNG VON BAKTERIEN Die Vermehrung von Bakterien ist meist asexuell und. durchläuft fünf Phasen, die sich in Bezug auf die Zellzahl und die Wachstumsrate unterscheiden. 1. Anlaufphase: niedrige Wachstumsrate, da wenige Individuen Anpassung an den Lebensraum (Enzymsynthese) • Bakterien nutzen diese Zeit, um Enzyme und andere Strukturen zu produzieren, die für das Wachstum unter optimalen Bedingungen erforderlich sind. 2. Exponentielle Phase: • maximale Wachstumsrate: sobald die Bedingungen optimal sind, beginnt die Bakterienpopulation rasch zu wachsen und die Zellzahl nimmt exponentiell zu • Je mehr Individuen, desto höher die Wachstumsrate. 3. Stationäre Phase: • Wachstum stagniert bzw. Wachstumsrate nimmt ab: Grund-Platz und Nahrungsmangel. • Die Zellzahl erreicht ein Plateau und bleibt konstant. Die Bakterien produzieren Abfallstoffe und verbrauchen Sauerstoff, was die Umweltbedingungen weiter verschlechtert. 4. Phase der Verknappung: • Wenn die Nährstoffe aufgebraucht sind, beginnt die Zellzahl abzunehmen: Bakterien beginnen zu sterben und die Wachstumsrate ist 0. lg der Zellzahl pro ml 5. Absterbephase: • Mangel an Nahrung und ungünstige Umweltbedingungen führen zum Absterben der Bakterienpopulation. 6 Q1.2 Gene und Gentechnik 4 3 888-Zellzahl ++ pro ml 108 5+105 - 104 107 Produktion primärer 106 Stoffwechselprodukte 10³ 2 - 10² 1 - 10¹ Produktion sekundärer Stoffwechselprodukte exponentielle Phase Aicha A.H stationäre Phase Anlaufphase 1 8 9 10 2 3 4 5 6 7 97.1 Wachstumskurve einer Bakterienkultur Absterbe- phase Stunden