Genetik

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Arten des Gentransfers Konjugation Austausch von genetischem Material zwischen zwei Zellen durch deren direkte Verbindung Transformation Die Übertragung von freier DNA in eine Zelle (ohne Hilfe von Viren) Transduktion DNA-Transfer mithilfe von Viren als Transporter DNA-Doppelstrangbruch Reparatur anhand Homologe und nicht homologe Rekombination Rekombination sowohl zwischen homologen, als auch heterologen Chromosomen möglich Homologe Rekombination Reperatur Bruch durch identisches/homologes DNA-Stück doppelsträngige DNA-Sequenzen müssen homolog sein . Rekombination sowohl während Meiose und Befruchtung, als auch bei Reperaturen der DNA -> DNA-Doppelstrangbrüche -> Verknüpfung zur Reperatur Nicht-homologe Verknüpfung der Enden (in Basenabfolge ähnlich) identische Stränge nähern sich bei homologer Reperatur an beschädigte Strang kann unter Vorlage des anderen repariert und wieder verknüpft werden meist fehlerfrei Heterologe Rekombination nicht identisch -> Bruchenden werden zurechtgeschnitten und direkt wieder verknüpft Teile der Sequenz gehen oft verloren Deletion Stammbaumanalyse Definition Mensch: Stammbaumanalyse um Merkmale über Generationen hinweg zurückzuverfolgen -> Augenfarbe -> vererbbare Krankheiten Einschätzung Risiko Erkrankung in Familie . Zwei Fragen für Stammbaum stellen ● Grundlagen ● . ● 1. Generation 2. Generation 3. Generation Ausprägung von Merkmalen wird durch Gene bestimmt (bestimmter Abschnitt auf Chromosomen) Stammbaum Tritt die Erbkrankheit in jeder Generation auf, oder nicht? Sind beide Geschlechter gleichermaßen von der Erbkrankheit betroffen oder ein Geschlecht besonders? jedes Gen für ein Merkmal doppelt (1x von Mutter, 1x von Vater) -> zwei Genvarianten: Allele WICHTIG Blutgruppe Mutter Augenfarbe Mutter Großeltern Eltern Allel und Gen Kombination aus beiden Allelen, die ein Merkmal bestimmen = Ausgeprägte Merkmal/Erbkrankheit = Phänotyp Ursache für Erbkrankheiten sind Defekte in einzelnen Genen, die vererbt werden Genotyp Vererbung von Merkmalen/Erbkrankheiten erfolgen nach den drei Mendelschen Regeln bei Stammbaumanalyse anwenden Nur bei Erbkrankheiten, die von einem Gen ausgelöst werden (monogen) ist Stammbaumanalyse sinnvoll. Vorgehen Schritt 1 Unterscheiden zwischen: autosomale Vererbung gonosomale Vererbung · Autosomaler Erbgang Gonosomaler Erbgang Chromosomensatz einer Frau erklären ob das defekte krankheitsauslösende Allel auf den 44 Körperchromosomen (Autosomen) oder den zwei Geschlechtschromosomen (Gonosomen) liegt Schritt 2 Autosomen Erbkrankheiten kommen in der Regel gleich häufig bei beiden Geschlechtern vor. Gene der Merkmale/der Krankheit liegen auf Autosomen. Jeder Mensch besitzt 22 homologe Autosomenpaare mit jeweils gleicher Abfolge an Genen. Unterscheiden zwischen: dominante Vererbung rezessive Vererbung 1 1 IC KAN X MAK • 오 Erbkrankheit tritt in der Regel besonders häufig bei einem Geschlecht auf. Gene der Merkmale/der Krankheit liegen auf Gonosomen. Bei Frauen sind das zwei X-Chromosomen; Bei Männern ein X- und ein Y-Chromosom. Dominanter Erbgang Krankheit tritt in jeder Generation auf. ein (dominantes) Allel reicht aus, um Krankheit im Phänotyp zu zeigen Großbuchstaben -> AA (homozygot), Aa (heterozygot) Rezessiver Erbgang Krankheit nicht in jeder Generation ausgeprägt beide (rezessiven) Allele müssen die gleichen Informationen tragen, um Krankheit im Phänotyp auszuprägen Kleinbuchstaben -> aa (homozygot) . ● 5 Möglichkeiten für einen Erbgang bei Stammbaumanalyse Autosomal dominanter Erbgang Autosomal rezessiver Erbgang . . . Grundbegriffe . Das Y-Chromosom besitzt allerdings nur sehr wenig Genmaterial -> Erbgang gilt nicht als gesichert . X-chromosomal dominanter Erbgang (Gonosomal) X-chromosomal rezessiver Erbgang (Gonosomal) Y-chromosomaler Erbgang (Gonosomal) Autosomal-dominanter Erbgang . leerer Kreis = Frau ohne Erbkrankheit farbig ausgefüllter Kreis = Frau mit Erbkrankheit leeres Viereck Mann ohne Erbkrankheit Beispiel -> Vielfingrigkeit farbig ausgefülltes Viereck = Mann mit Erbkrankheit Kreis/Viereck mit Punkt in der Mitte = Konduktor/in (Überträger/in) Autosomal dominanter Erbgang überspringt kranker Vate defekte Allel liegt auf Autosomen Merkmalträger/betroffene Personen können homozygot (AA) oder heterozygot (Aa) sein ein defektes Allel reicht für Ausprägung Krankheit aus -> da dominantes Allel krankes Kind gesundes Kind gesundes Kind gesunde Mutter krankeser Grundbegriffe Stammbaum mannliche Person ohne Merkmal O weibliche Person ohne Merkmal Merkmalsträger Generation! O Konduktor/in (Ubertrager/in) Generation Stammbaum (autosomal dominanter Erbgang) Generation O 10 1 4 1 Merkmale • • ● Konkretes Beispiel Merkmal tritt in jeder Generation auf Verhältnis der erkrankten Männer und Frauen sit ausgewogen -> Männer Frauen = 4:4 -> Nachkommen (12) von gesunden Eltern (5 und 6) auch alle gesund • ● Autosomal- rezessiver Erbgang Krankheit kommt in jeder Generation vor, jeder Betroffene hat also ein betroffenes Elternteil ● ca 50% aller Nachkommen eines betroffenen Elternteils sind ebenfalls betroffen Erbkrankheit kann bei beiden Geschlechtern im gleichen Verhältnis auftreten Nachkommen eines gesunden Familienmitglieds sind gesund ● ● Beispiel defektes Allel liegt auf Autosomen rezessives Allel -> nur homozygoter Genotyp aa bestimmt Ausprägung Krankheit bei heterozygotem Genotyp Aa setzt sich das gesunde dominante Allel A im Phänotyp durch = Person ist gesund Merkmale Albinismus Stammbaum (autosomal rezessiver Erbgang) Generation 1 Generation III AA/A 9 OMA AAJA DO AA bei betroffener Person sind meist beide Eltern nicht betroffen -> Auftreten Krankheit überspringt Generationen Vererbung ist unabhängig von Geschlecht -> beide Geschlechter erkranken im gleichen Verhältnis Personen, die Merkmal der Krankheit in sich tragen, aber selbst phänotypisch gesund sind Aa, sind Konduktoren/Überträger Konkretes Beispiel Merkmal tritt nicht in jeder Generation auf -> 2. Generation wird übersprungen beide Geschlechter sind gleichermaßen betroffen -> Männer Frauen = 1:1 X-chromosomal-dominanter defektes Allel liegt auf einem X-Chromosom (Gonosomen) X = dominant, x = rezessiv, Y = nicht von Bedeutung defekte Allel auf X-Chromosom ist hierbei dominant Beispiele Alport-Syndrom Merkmale Erbgang Stammbaum (X-Chromosomal dominanter Erbgang) Generation! Generation II Generation SON KY ** ein Geschlecht ist in der Regel häufiger von der Erkrankung betroffen (da defektes Allel auf Gonosomen liegt) Konkretes Beispiel Merkmal tritt in jeder Generation auf mehr Frauen als Männer erkrankt-> gonosomale Vererbung -> Männer Frauen = 3:5 OON Krankheit kommt in jeder Generation vor, jeder betroffene hat ein betroffenes Elternteil X-chromosomal-rezessiver Erbgang defektes Allel liegt auf einem X-Chromosom (Gonosom) krankheitsverursachende Allel ist rezessiv -> nur Genotyp xx oder XY führt zur Ausprägung Krankheit -10 ein betroffener Vater (XY) hat immer kranke Töchter, weil er ihnen immer das defekte Allel vererbt 15 Beispiel Rotgrünblindheit Merkmal . Stammbaum (X-Chromosomal rezessiver Erbgang) Generation Generation Generation III 4 9 11 ein Geschlecht ist in der Regel häufiger von der Erkrankung betroffen (da defektes Allel auf Gonosomen liegt) betroffene Männer sind immer auch erkrankt (Merkmalsträger) Frauen können auch Konduktorinnen sein (Xx) und somit phänotypisch gesund sein bei betroffenen Personen sind meist beide Eltern nicht betroffen -> Auftreten Krankheit überspringt Generationen Konkretes Beispiel Merkmal tritt nicht in jeder generation auf (Generation 1 ist merkmals frei) es sind mehr Männer als Frauen von einer Merkmalsausprägung betroffen -> Männer Frauen = 3:1 Proteinbiocynthese Definition auch Genexpression genannt Übersetzung von DNA-Abschnitten in Proteine -> Transkription -> Translation ● ● PROTEINE ● ● ● Bauplan für Proteine ist im Erbgut der DNA gespeichert -> jeder Abschnitt/Gen ist für Herstellung eines Proteins zuständig hergestellten Proteine wirken meist als Enzyme und steuern Vorgänge im Körper -> kann sich auch auf Phänotyp auswirken -> Herstellung Farbe für Augen Mensch: Proteinbiosynthese 1. im Zellkern (Transkription) 2. im Cytoplasma an Ribosomen in Zellen (Translation) Ketten aus miteinander verknüpften Bausteinen = Aminosäuren jedes Protein besitzt einzigartigen Aufbau je nachdem welche/wie viele Aminosäuren beteiligt sind Ablauf ● Transkription . Ablauf der Proteinbiosynthese VAN Weg vom Gen zum hergestellten Protein = entschlüsseln des genetischen Codes -> Körpergröße, Haar- und Augenfarbe Transkription - Translation durch Enzyme vermittelter Prozess Übertragung der in der DNA enthaltenen Informationen Anfertigung transportfähige Kopien der DNA-Stränge (mRNAs) Eukaryoten: im Zellkern Prokaryoten: im Zellplasma Translation • . ● WICHTIG RNA-Prozessierung als Zwischenschritt bei Eukaryoten Übersetzung der in der Boten-RNA gespeicherten Informationen Entstehung Kette aus aneinandergereihten Aminosäuren = Protein an Ribosomen im Zellplasma Ablauf Transkription DNA wird in eine mRNA übertragen ● Initiation Elongation Termination 1. Initiation . Startpunkt für Transkription ist der Promotor -> Basensequenz (häufig Adenin und Thymin) ● Erstellung der mRNA nicht für den gesamten DNA-Doppelstrang wird mRNA-Kopie erstellt, nur von kurzem Abschnitt -> Bauplan für Protein -> Herstellung Protein bei Translation Enzym RNA-Polymerase für Erzeugung mRNA RNA RNA-Polymerase RNA-Polymerase setzt sich an DNA und fährt sie ab RNA-Polymerase am Promotor angekommen > Beginn Entwirrung und Aufspaltung Doppelhelix Bildung zwei Einzelstränge: codogener und nicht-codogener Strang Codogener Strang (Vorlagestrang) = wichtiger Strang für Transkription -> enthält wichtige Informationen für Proteinherstellung 2. Elongation . -> vervollständigt Doppelstrang -> zwei Basen bilden ein Basenpaar ● alle komplementären Basen werden aneinander geknüpft -> Entstehung lange Kette = mRNA Komplementäre Basen Guanin und Cytosin Adenin und Uracil RNA-Polymerase liest Vorlagestrang ab RNA-Polymerase setzt jeder Base eine komplementäre Base gegenüber Termination ● ● ● RNA-Polymerase kommt an Stopp-Punkt (Terminator) an Transkription endet WICHTIG RNA-Polymerase bildet aus DNA wieder eine Doppelhelix RNA-Polymerase löst sich von Doppelhelix . RNA enthält Base Uracil anstelle von Thymin (wie in DNA) Ablauf Translation mRNA wird in Proteine übersetzt im Cytoplasma an Ribosomen der Zelle Vor Translation mRNA kommt im Cytoplasma an Ribosom setzt an und fährt Strang ab Bau eines Ribosoms Polypeptid-Stelle Exit-Stelle 90 Aminoacyl-Stelle Drei Bindungstellen ● ● ● • 1. Initiation • . Ribosom fährt an mRNA entlang und untersucht drei Basen gleichzeitig -> Basen-Triplett/Codon ● A-Stelle (Aminoacyl-Stelle) P-Stelle (Polypeptid-Stelle) E-Stelle (Exit-Stelle) 2. Elogation ● • ● Ablauf der Translation ● Aminosäurekette tRNA besitzt Basen-Triplett das genau komplementär zum Codon auf der mRNA (hier: Start-Codon) passt -> Anti-Codon jedes Anti-Codon steht für eine Aminosäure -> tRNA trägt Aminosäure an ihrem oberen Ende weitere passende tRNA kann sich an freie A-Stelle anlagern . Ribosom ERNA TEMTHILIA Translationsrichtung Start- Codon AUG ist an P-Stelle des Ribosoms passende tRNA dockt an P-Stelle Aminosäure der tRNA löst sich an P-Stelle Aminosäure hängt sich an Aminosäure der tRNA in A-Stelle Ribosom bewegt sich ein Triplett weiter -> beide tRNAs rutschen eine Stelle weiter erste tRNA befindet sich an E-Stelle tRNA löst sich vom Ribosom und geht wieder in das Cytoplasma über in freie A-Stelle kann sich neue tRNA anlagern tRNA mit wachsender Aminosäurekette liegt an P-Stelle von hier können Aminosäuren wieder zur tRNA an A-Stelle wandern Vorgang wiederholt sich immer wieder -> Entstehung lange Kette aus Aminosäuren Ribosom erreicht Codon mit Basenfolge AUG -> Start Translation Start-Codon mRNA 3. Termination Ablauf läuft fort bis Ribosom ein Stopp-Codon (UAA, UAG, UGA) erreicht -> Basenfolge signalisiert Ende der Translation -> Aminosäurekette löst sich von tRNA ● Proteinbiosynthese bei Eukaryoten und Prokaryoten Ablauf Proteinbiosynthese grundlegend gleich Ort unterschiedlich Schritt RNA-Prozessierung Unterschied . ● Eukaryoten Ort Transkription: Zellkern (Ort DNA) Ort Translation: Cytoplasma an Ribosomen gebildete Aminosäurekette stellt ein Protein dar Protein wandert zu Einsatzort ● RNA-Prozessierung • ● • Schematischer Ablauf RNA-Prozessierung pra-mRNA Prozessierung mRNA Transport hergestellte mRNA von Zellkern in Cytoplasma notwendig mRNA muss enge Kernporen des Zellkerns passieren -> mRNA kann beschädigt werden RNA-Prozessierung im Zellkern zur Verhinderung Entfernung Introns (unwichtige/nicht codierende Zwischenstücke) Kappe O Exons o mRNA bekommt zwei Enden (Kappen) und einen Schwanz -> Moleküle schützen Enden vor Abnutzung -> Verlängerung Lebensdauer Introns werden herausgeschnitten Exons (wichtige Abschnitte) bleiben übrig -> Informationen Proteinherstellung mRNA ist bereit für Translation -> wird aus Zellkern in Cytoplasma transportiert Prokaryoten Ort Transkription: Cytoplasma -> da kein Zellkern, DNA liegt dort frei vor ● Risiko Beschädigung ist geringer -> Verpackung zum Schutz nicht nötig Zwischenschritt RNA-Prozessierung zwischen Transkription und Translation fällt weg mRNA die bei Transkription gebildet wird hat keinen weiten Transportweg zu Ribosomen . Genregulation Definition • ● verantwortlich für Steuerung/Regulation der Genaktivität/Genexpression -> bestimmt ob/wie oft Gen abgelesen wird -> legt fest welche Proteine hergestellt werden (Genexpression) notwenig damit Körperzellen unterschiedliche Funktionen haben Regulation: nur für Körper notwenige Proteine werden produziert -> restliche Gene sind ausgeschaltet -> Energie sparen Genregulation an unterschiedlichen Punkten der Proteinbiosynthese möglich ● Aufbau Operon Genregulation bei Prokaryoten Regulatorgene sind in bestimmten Funktionseinheiten auf DNA orgnisiert -> Einheit = Operon -> Regulation = Operon-Modell wichtig für Anpassung an veränderte Umweltbedingungen Genregulation Übersicht Transkription Promotor reguliert Start Transkription durch Wechselwirkung mit RNA-Polymerase Operator reguliert Transkription durch Bindung von Regulationsfaktoren (Repressor/Aktivator) Strukturgene Gene die durch Operon reguliert werden ● mRNA Regulatorgen codiert für Aktivatoren und Repressoren (Regulationsfaktoren) Aufbau Operon Regulator- Promotor gen Dperon Operator Protein Gen 1 Strukturgene- Substratinduktion und Endproduktrepression 1. Genregulation durch Substratinduktion 2. Genregulation durch Endproduktrepression Substratinduktion ● Lac-Operon (Substratinduktion) • . -> keine Lactose vorhanden -> Lactose vorhanden . Keine Lactose vorhanden • Substrat induziert Genexpression Substrat bindet an Repressor und deaktiviert ihn ● im Bakterium E. coli in Bakterien ist Lactose Operon für Abbau Milchzucker (Lactose) verantwortlich Strukturgene produzieren Enzym das Lactose abbaut abhängig von Konzentration sind Gene an- oder ausgeschaltet . Zelle muss kein Enzym zur Spaltung herstellen Regulatorgen produziert aktiven Repressor -> verhindert Genexpression -> hindert RNA-Polymerase den DNA-Strang abzulesen -> kein Lactose-abbauendes Enzym wird hergestellt aktiver Repressor bindet an Operator Lactose vorhanden . Zelle muss Enzym zur Spaltung herstellen Repressor wird durch Lactose inaktiviert Lac Operon ohne Lactose RNA-Polymerase egulatorgen Promotor Operator 10000 Lac Operon mit Lactose ANA Polymerase Regulatorgen Promotor Operator www.promotor -> Lactose bindet an zweite Bindestelle des Repressors (allosterisches Zentrum) Bindung Substrat führt zu Änderung in Raumstruktur Repressor -> kann nicht mehr an DNA binden -> RNA-Polymerase kann Strang ungehindert ablesen und Lactose-abbauendes JAL Lactose Enzym herstellen Lactose induziert. Transkription des Enzyms -> Lactose = Induktor genügend Lactose abgebaut -> Repressor wieder aktiv und hemmt Transkription Endproduktrepression/Produktrepression Endprodukt verhindert Transkription von Strukturgenen -> durch Aktivierung Repressor (Umkehrung Substratinduktion) Tryptophan-Operon (Endproduktrepression) im Bakterium E. coli Tryptophan-Operon ist für Synthese der Aminosäure Tryptophan verantwortlich Bestandteile Operon haben grundsätzlich gleiche Funktion wie bei Substratinduktion -> aber Repressor wird durch Endprodukt aktiviert anstatt durch Substrat inaktiviert zu werden Tryptophan-Operon ohne Tryptophan Regulatorgen • Repressor Kein Tryptophan vorhanden Regulatorgen produziert inaktiven Repressor solange kein Tryptophan vorhandnen ist bleibt Repressor inaktiv -> RNA-Polymerase kann DNA ablesen -> für Tryptophan Produktion benötigte Enzyme können hergestellt werden mRNA Tryptophan-Operon mit Tryptophan trp-Gene Regulatorgen inaktiver Repressor Repressor >Stopp der Transkription Tryptophan vorhanden Folge: Anstieg Tryptophan Konzentration -> Aminosäure bindet an Repressor und aktiviert ihn -> Strukturveränderung Protein -> Repressor kann an DNA binden und verhindert weitere Transkription durch Polymerase -> Folge: Tryptophan wird nicht mehr produziert Je höher die Tryptophan Konzentration, desto mehr inhibiert es seine eigene Synthese. Gentechnik Definition Verfahren mit denen Erbgut (DNA) gezielt künstlich verändert werden kann -> genetisch veränderte Organismen (GVO) Gentechnologie: Veränderung -> neue Kombinationen (Rekombinationen) -> Übertragen von genetischem Material (innerhalb einer Art oder zwischen verschiedenen Arten) -> da genetischer Code bei Lebewesen gleich Beispiel: Anti-Matsch Tomate (länger genießbar) Anwendungsgebiete . grüne Gentechnik: Pflanzenzüchtung (Agrotechnik) rote Gentechnik: Medizinische Biotechnologie weiße Gentechnik: Industrielle Biotechnologie . graue Gentechnik: Umweltbiotechnologie blaue Gentechnik: Aquatische Biotechnologie Rote Gentechnik Gentechnik Medikamentenherstellung genetische Veränderung Mikroorgansimen -> Produktion Medikamente in grösseren Mengen Beispiel: Insulin Gentechnik Anwendungsgebiete rote Gentechnik Medizin, Pharmazie graue Gentechnik Umwelt, Müll alle genetischen Veränderungen im Bereich Medizin und Pharmazie Herstellung Medikamente Diagnostik von genetischen Erkrankungen Gentherapie blaue Gentechnik Meer weille Gentechnik grüne Gentechnik Pflanzen, Landwirtschaft Diagnostik Verwendung Gentests zur Veränderung im Genom (Erbmaterial Zelle) festzustellen -> Ursache für viele genetische Erkrankungen ● Gentherapie Behandlung von Krankheiten durch Übertragung von genetischem Material im Körper -> defekte Gene ersetzen -> Gene Editing: Reparatur Gene Weisse Gentechnik ● . Graue Gentechnik • . ● . Einsatz biotechnologischer Methoden in der industriellen Produktion Herstellung Nahrungsmittel oder Chemikalien mithilfe von Mikroorganismen Beispiel: Einsatz Hefe für Bierherstellung, Enzyme in Waschmitteln Beispiel: Mikroorganismen in Kläranlagen -> ernähren sich von Nährstoffen in Abwasser biologischer Abbau von Abfall und Schadstoffen Reinigung von Wasser Abbau von Plastik oder generell Müll Entfernung von Verunreinigungen durch Schadstoffe Blaue Gentechnik ● Methoden für im Meer lebende (marine) Organismen marine Lebewesen mit guter Anpassung an extreme Bedingungen sollen neue biologische Substanzen für Einsatz in technischen Prozessen bieten Beispiel: Tiefseebakterien -> können Enzyme mit speziellen Eigenschaften enthalten ● Grüne Gentechnik Wie funktioniert Gentechnik? verschiedene Methoden zur Veränderung der DNA 1. Herstellung genetisch veränderter DNA 2. direkte oder indirekte Einbringen des modifizierten Erbmaterials in den Organismus alle Methoden zur gentechnischen Veränderung von Pflanzen- zum Einsatz von Gentechnik in Landwirtschaft Beispiel: Anti-Matsch Tomate, Golden Rice PCR (Polymerasekettenreaktion) Vervielfältigung bestimmter DNA-Abschnitte Vergrößerung Menge Erbgut -> beispielsweise zur Veränderung des Zielorganismus geringe Menge DNA reicht aus . DNA-Sequenzierung Reihenfolge einzelner Basen in DNA-Strang wird ermittelt Entschlüsselung genetischer Information hilft bei Erkennung genetischer Erkrankungen -> Mutationen sind oft Grund für genetische Defekte nur durch Erkennung Veränderung ist Gentherapie möglich DNA-Klonierung Veränderung DNA-Strang und Übertragung in Organismus Einsetzen DNA-Stück in bakteriellen DNA-Ring (Plasmid) -> beide DNA-Stränge werden mit gleichem Restriktionsenzym geschnitten -> Entstehung überlappende Enden -> Zusammenkleben mit Ligasen Beispiel: Einbringen menschliche Insulin-Gen zur Produktion von Insulin über Plasmid in Bakterien . ● Genome Editing Techniken für gezielte Veränderung des Erbguts von -> Mikroorganismen (weisse Gentechnik) -> Pflanzen (grüne Gentechnik) -> Tiere oder Menschen (rote Gentechnik) CRISPR-Cas Methode ● -> Verteidigungssystem von Bakterien -> gezielter Abbau/Zerschneiden von fremder DNA gezielte Veränderung DNA an bestimmten Stellen durch Enzym auch möglich -> Einfügen, Entfernen und Ausschalten bestimmter Gene durch Enzyme Direkter Gentransfer Übertragung veränderter DNA in Zielorganismus -> direkte Übertragung möglich Methoden: Mikroinjektionen, Genkanone . Mikroinjektion gezielte Übertragung Genmaterial mittels Injektionen in Zelle ● Genkanone ● ● Beschießung Zellen DNA wird auf sehr kleine Partikel übertragen mit denen man schießen kann Teilchen werden durch Kanone mit Druckluft beschleunigt und in Zelle übertragen Indirekter Gentransfer durch Vektoren . indirekte Übertragung Gene auf andere Organismen -> Vektoren = Transportmittel für DNA (Plasmide aus Bakterien oder virale Vektoren/modifizierte Viren) Restriktionsenzyme Definition kann bestimmte DNA Sequenzen erkennen und schneiden -> molekulare Schere/Restriktionsendonuklease die Bindungen in der DNA gezielt spaltet natürliches Abwehrsystem in Bakterien gegen angreifende Viren künstlicher Einsatz zur Klonierung in Gentechnik Bedeutung Schneiden DNA -> auseinander schneiden Doppelstrang genau zwischen zwei Basenpaaren -> arbeiten sehr spezifisch Schnittstellen sind durch Erkennungsfrequenz bestimmt -> Enzyme erkennen Sequenzen mit Länge zwischen 4 und 8 Basenpaaren und palindromischer Sequenz (beide Stränge aus gleicher Richtung gelesen gleich) 5'- GAATTC- 3' -> 3'- CTTAAG- 5' <ー Genauigkeit ist wichtig für Gentechnik -> Klonierung: gezieltes Zerschneiden und Zusammenbauen DNA-Sequenzen -> Prokaryoten: Abwehr gegen Viren (fremde DNA wird schnell erkannt und abgebaut) -> Unterscheiden fremde und eigene DNA -> Methylierung eigener DNA (Markierung DNA-Strang) ● Fremd-DNA geschnittene DNA Klassifizierung Typ 1 Restriktionsenzyme in Bakterien . vier Gruppen mit verschiedenen Eigenschaften -> Aufbau -> Funktionsweise . J 13! Typ 2 Restriktionserzym ungeschnittene DNA zufälliges Schneiden der DNA weit weg von ihren Erkennungssequenzen komplexes Enzym mit mehreren Untereinheiten Energie (ATP) wird für Funktion benötigt Restriktion und Modifikationen (Übertragung Methylgruppen) schneiden nah oder innerhalb ihrer Erkennungssequenzen -> genau definierte Schnittprodukte Zerschneiden palindromischer Sequenzen bis Länge von 8 Basenpaaren keine Energiezufuhr notwendig kommt am häufigsten vor Einsatz im Labor -> Gentechnik (Klonierung), epigenetische. Forschung (Erkennung Krankheiten) Typ 3 Kombinationsenzyme -> Restriktion -> Modifikationen ca. 20-25 Basenpaare vor Erkennungsfrequenz zerschneiden ATP notwendig Erkennungsfrequenz muss zweimal vorkommen und entgegengesetzt orientiert sein Typ 4 zur modifiziertes Schneiden -> z.B. methylierte DNA Bakterium E. coli Beispiel EcoRI Typ 2 Eco: Bakterium Escherichia coli R: Buchstabe für Stamm I: römische Zahl 1 = erstes Enzym in E. coli gefunden In Gentechnik sticky ends and blunt ends im Vergleich sticky ends > EcoRI GAATTC CITAAG -CITAA AATTC blunt ends > EcoRv GATATC -CTATAG -GAT ℗ATC -CTA TAG DNA-Klonierung (Typ 2) -> identische Vervielfältigung von DNA-Sequenzen -> Einbau DNA-Stücke in Plasmid (ringförmiges DNA-Molekül) -> dient als Vektor für Transport Plasmid und einzubauende DNA (Insert) müssen mit gleichem Enzym geschnitten werden > Restriktionsverdau -> DNA-Sequenz und Enzym müssen in Pufferlösung gemischt werden -> Schneiden an Erkennungsfrequenz -> DNA-Stück entweder direkt aus Genom oder Produkt aus PCR je nach Schnittweise entweder -> sticky ends (klebrige Enden), versetzt geschnitten, überlappende Enden mit komplementären Basen -> blunt ends (stumpfe Enden), gerade Schnitte verschiedene Enden die mit gleichem Enzym geschnitten wurden können mit Ligase wieder zusammengeklebt werden (Ligation) -> Plasmid mit zusätzlichem DNA-Abschnitt (Insert) Klonierung Insert Restriktion Ligation OFOTO Insert Restriktionsanalysen mithilfe von Restriktionsverdau -> Charakterisierung von DNA durch gezielte Spaltung -> Produkte aus Restriktionsverdau werden durch Gelelektrophorese nach Größe aufgetrennt -> Rückschlüsse über Größe und Aufbau Plasmid und Position von Schnittstellen möglich -> genetische Unterscheidung von Tierarten oder Viren möglich Vektoren Definition Transportmittel für Nukleinsäuren (DNA) -> Gentransfer (Einbringen/Übertragen Fremder-DNA in Wirtszelle) -> genetische Modifizierung -> DNA-Fragment wird in Vektor integriert, Vektor wird als Transportmittel der Fremd-DNA in entsprechenden Organismus eingebracht eigene Vektor-DNA . Eigenschaften Vektoren müssen replizierbar sein -> Vektor kann durch DNA-Polymerase verdoppelt werden (nach Gentransfer) -> nötig um integrierte Fremd-DNA in nächste Generation der Zelle weiterzugeben -> Bedingung: Erkennungssequenzen (Startpunkt) für Restriktionsenzyme (DNA-Polymerasen) . Vektoren müssen einfach und in größeren Mengen isolierbar sein -> meiste Vektoren sind aus Bakterien und Viren leicht . Vektor-DNA müssen geeignete Schnittstellen für Restriktionsenzyme besitzen ->Zerschneiden Vektor-DNA ist notwendig für Integrierung Fremd-DNA (Lücke) ● Vektoren müssen der Wirtszelle bestimmte Eigenschaften verleihen -> nötig für Selektion zwischen Wirtszelle mit und ohne integrierter Fremd-DNA • Vektortypen Plasmidvektoren ● . ● . kleine ringförmige DNA-Struktur in Zellplasma von Prokaryoten Teil Erbgut zum Genom der Bakterien enthalten bestimmte Gene -> werden in Proteine umgesetzt (für Anpassung an Umwelt) Beispiel: Antibiotikaresistenzen Aufbau ● ● . -> Erkennungsfrequenz an die Replikationsenzyme (DNA-Polymerase) binden Vervielfältigung Vektor maximale Kapazität: ca 10-15 kbp (10 000 150 000 Basenpaare) Einsatz in Gentechnik Gensequenzen für Antibiotikaresistenzen -> Modifizierung Plasmide um Gensequenzen mit Antibiotikaresistenzen in Bakterien zu haben entscheidend für Selektion transgener Bakterien ringförmige DNA-Fragmente die aus Bakterien isoliert werden Startstelle Replikation -> Erkennungssequenzen -> Einfügungsstelle für DNA-Fragment -> Erkennungssequenzen innerhalb Genabschnitts für Resistenzen • Gentransfer Schnittstelle für Restriktionsenzyme Transformation = Integration Fremd-DNA in Organismus ohne Viren oder Spenderzelle -> Integration DNA-Fragmente mithilfe von Restriktionsenzymen und Ligasen -> erfolgreiche Integration = Hybridplasmid -> Aufnahme Vektoren durch Transformation geeignete Bakterienzellen (Selektionsverfahren) -> zwei Antibiotikaresistente Gene auf Plasmid nötig (Unterscheidung Bakterien mit und ohne Fremd-DNA) . Virale Vektoren • Viren vermehren sich durch Integration Genom (Erbgut) in Wirtszelle Einsatz Gentechnik -> genetische Modifizierung Virus-Partikel um DNA-Fragment in Wirtszelle einzubringen (Gentransfer durch Viren = Transduktion) Beispiel: Vektorimpfstoffe -> Injizierung unschädlich gemachter Viren Bakteriophagen Viren die Bakterienzellen befallen schleusen Genom von außen in Wirtszelle modifizierte Bakteriophagen als Vektoren -> Kapazität des integrierten DNA-Fragments variiert Klonierungsvektoren und Expressionsvektoren Einbringen Fremd-DNA in Wirtszelle Vervielfachung/Klonierung Vektor (Umsetzung in Proteine) durch Vermehrung ● . . . Wirtszelle ->induzieren Umsetzung integrierter Fremd-DNA in mRNA (Transkription) -> Umsetzung in Proteine (Translation) Bioethik Chancen . . ● Mikroorganismen und Viren in der Biotechnik . Medizin -> Produktion von Human-Insulin Lebensmittelherstellung -> Steigerung der Produktivität von Bakterien und Hefen für Herstellung von Backwaren etc. Rohstoffgewinnung -> effektivere Alkoholherstellung Umweltschutz • Heilen von Krankheiten mithilfe bestimmter Produkte • ethische Reflexion über Umgang Menschen mit belebten Umwelt (medizinische und biotechnische Anwendungen) Lösen von Ernährungsproblemen, Ertragssteigerung -> Abwasserreinigung, Kompostierung, Schadstoffabbau Gendiagnostik frühzeitiges Feststellen von Erbkrankheiten -> vorbeugende medizinische Maßnahmen bereits vor Krankheitsausbruch möglich humangenetische Beratung bei Ehepaaren mit gehäufter Erbkrankheit in Familie Riskien Verdrängung natürlich vorkommender Populationen durch transgene Tiere wegen Konkurrenz -> Nahrung . Anwendung auf Menschen: Mensch sollte nicht willkürlich zum Objekt der Forschung werden (Würde) unabsichtliche Erzeugung von Krankheitserregern Freisetzen transgener Mikroorganismen und Viren -> eventuell horizontaler Gentransfer zu anderen Organismen -> Entstehung neuer Genkombinationen mit unvorhersehbaren Wirkungen möglich Information über gesamtes menschliches Erbgut aus kleinsten DNA-Proben Jobangebote, Kranken- und Lebensversicherungen nur nach Kenntnis des Genoms des Kandidaten nach Gentest: Leben mit dem Wissen dass möglicherweise tödliches Leid auftreten könnte ● Gentherapie Untersuchung von Embryonen auf krankhaft veränderte Gene Täteridentifikation in Kriminalistik mit DNA-Spuren somatische Gentherapie mutierte Gene werden in menschlichen Körperzellen (Somazellen) durch funktionierende ersetzt ● -> Nachteil: Auswikungen Therapie bleiben auf behandeltes Individuum beschränkt (keine Effekte auf Keimzellen) Keimbahntherapie Einbringen der zu ersetzenden Gene in Keimzellen oder frühe Embryonen . -> Vorteil: eingeschleuste Gene werden auch an Nachkommen weitergegeben -> Nachteil: unkalkulierbare Risiken für Folgegenerationen . • theoretische Möglichkeit der gezielten Manipulation jeder genetischen Information ,,Menschen nach Maß" durch exakt geplante Eigenschaften der Embryonen Meiose Definition Meiose/Reifetilung ist eine Art Kernteilung mit zwei Schritten Bildung haploide (einfache) Tochterzellen Keimzellenbildung ist Grundlage/Vorbereitung für geschlechtliche Fortpflanzung -> Meiose 1 (Reduktionsteilung) -> Meiose 2 (Äquationsteilung) Ziel Produktion haploide Geschlechtszellen (Gameten) -> Eizellen (Oozyten) und Samenzellen (Spermien) Wichtigkeit Meiose ist für Fortpflanzung erforderlich -> wenn Keimzellen nicht haploid sondern diploid dann würde sich Chromosomensatz von Generation zu Generation verdoppeln -> durch Meiose bleiben es beim Menschen 46 Chromosomen Ablauf Meiose 1. Meiose 1 -> Prophase 1 -> Metaphase 1 -> Anaphase 1 -> Telophase 1 2. Meiose 2 -> Prophase 2 -> Metaphase 2 -> Anaphase 2 ->Telophase 2 Ablauf der Meiose ● Meiose 1 (Reduktionsteilung/1. Reifeteilung) Interphase vor Meiose 1 -> Verdopplung Zellorganellen und genetisches Material nun Zwei-Chromatid-Chromosomen ● . ● Trennung homologer Chromosomenpaare -> Paare in Abfolge und Gestalt den Genen ähnlich (codieren für dieselben Merkmale) homologe Chromosomen sind in diploiden Zellen (doppelter Chromosomensatz) -> 1 von Mutter -> 1 von Vater Prophase 1 . • . nur bei Lebewesen mit Zellkern möglich . • • Meiose I Prophase 1 Metaphase 1 Anaphase 1 Telophase 1 1. Lepotän DNA verdichtet sich zu Chromosomen (Kondensation) Chromosomen sind unter Mikroskop als zwei Chromatiden mit Centromer erkennbar ● 3. Pachytän Prophase 1 Chromosomen spiralisieren sich -> werden in X-Form sichtbar homologe Chromosomen lagern sich aneinander -> Rekombination Genmaterial Kernhülle löst sich auf Spindelapparat bildet sich 2. Zygotän Bildung homologer Chromosomenpaare aus jeweils einem väterlichen und einem mütterlichen Chromosom (Synapsis) Chromosomen kondensieren weiter un Chromatiden der homologen Chromosomen überkreuzen sich -> Rekombination (Austausch genetische Informationen = Crossing-over) -> genetische Vielfalt Nachkommen wird vergrößert 4. Diplotän homologe Chromosomenpaare trennen sich weitestgehend auf und bleiben nur noch an einigen Punkten verbunden -> Überkreuzungspunkte Chiasmata . 5. Diakinese ● Metaphase 1 ● ● Kernkörperchen (Nucleolus) und Kernmembran lösen sich auf Bildung Spindelapparat (Gerüst aus Mikrotubuli) . Anordnung Chromosomen in Äquatorialebene (Mitte der Zelle) Fortsetzung Bildung Spindelapparat an Zellpolen Andockung Spindelapparat an Centromeren der Chromosomen Anaphase 1 Metaphase 1 Aquatorialebene Spindelapparat Centromer Trennung homologe Chromosomenpaare von Spindelfasern, GANZE Chromosomenpaare werden zu Polen gezogen genetische Variabilität da zufällige Verteilung Centromer Anaphase 1 Aquatorialebene >Gesamte Chromosomen Telophase 1 Bildung Kernhülle um beide Chromosomensätze Trennung beider entstandenen Tochterzellen -> Cytokinese -> jeweils einen haploiden Chromosomensatz (Zwei-Chromatid-Chromosomen) -> Erbgut beider Tochterzellen ist unterschiedlich Telophase 1 Meiose 2 (Äquationsteilung/2. Reifeteilung) ● F nach Cytokinese Meiose 1 Interkinese vor Meiose 2 -> Ruhephase (keine Verdopplung Chromosomen) Beginn: zwei haploide Tochterzellen mit Ein-Chromatid-Chromosomen relativ ähnlich zu Mitose (einfache Teilung Zellkern) -> Unterschied: nach Meiose 2 vier haploide Tochterzellen Prophase 2 ● Cytokinese Mutterzelle hat nur einen haploiden Chromosomensatz -> keine Interphase zwischen Meiose 1 und Meiose 2 (Material wird nicht verdoppelt) Bildung neuer Spindelapparat in beiden entstandenen Zellen Prophase 2 Spindelapparat Metaphase 2 erneute Anordnung Chromosomen in Äquatorialebene Metaphase 2 Anaphase 2 Verkürzung Spindelfasern -> einzelne Chromatiden werden zu Polen gezogen (nur EINZELNE Chromatiden werden aufgeteilt) Anaphase 2 Aquatorialebene Telophase 2 Bildung neuer Kernhüllen um Chromatide der beiden neuen Zellen Bildung neuer Kernmembranen Telophase 2 . eine ursprüngliche Zelle zwei Meiose Abschnitte Bedeutung Meiose wichtig für geschlechtliche Fortpflanzung -> verantwortlich für Bildung haploider Geschlechtszellen (Gameten) -> Neukombination genetischer Informationen -> genetische Vielfalt Fehler bei Meiose: Krankheiten Beispiele Erbkrankheiten durch Fehler bei Meiose Trisomie 21/Down Syndrom -> vier haploide Tochterzellen Chromosomenanomalie hat zwei Ursachen . -> homologe Chromosomen konnten während Meiose 1 nicht getrennt werden -> Chromatiden konnten während Meiose 2 nicht getrennt werden Entstehung Keimzellen die Chromosom 21 doppelt enthalten weiteres Chromosom 21 kommt bei Befruchtung hinzu -> befruchtete Eizelle (Zygote) enthält drei Chromosomen 21 = trisome Zygote Klinefelter Syndrom Krankheit bei Männern bei der Gameten abnormal verteilt sind übliche Chromosomensatz Männer: XY-Chromosomen (Y = Ausbildung männlicher Merkmale übliche Chromosomensatz Frauen: XX-Chromosomen (X = Ausbildung weiblicher Merkmale) Betroffene Männer besitzen ein zusätzliches X-Chromosom (XXY) -> XX-Chromosomensatz der Frau konnte sich nicht korrekt trennen -> zwei X-Chromosomen können bei Zellteilung in gleiche Tochterzelle gelangen