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Gentechnik
3.1.2021
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Gentechnik - Genetik - Biologie Werkzeuge der Gentechnik 1. Plasmide Plasmide findet man in den Prokaryoten, es ist ein zusätzliches Minichromosom mit einer klei- nen Anzahl von Genen, das sich unabhängig repliziert. Plasmide können unter Bakterien aus- getauscht werden und dienen daher als Vektor. Die Aufnahme eines Plasmides bezeichnet man als Transformation und das enstehende Plasmid als rekombinantes Plasmid. 2. Restriktionsenzyme Sie schneiden die DNA an einer definierten Stelle (Restriktionsschnittstelle). Diese ist meist 4- 8 Basenpaare lang und palindromisch aufgebaut, das hießt sie ist von links, sowie rechts les- bar. Die Enzyme schneiden versetzt, sodass Einzelstrangüberhänge (sticky ends) entstehen. 5'G|AATTC 3' An der roten Stelle schneidet das Enzym die Stränge 3' CTTAA | G5' → unterschiedliche Kombinationen sind möglich, die Einzelstränge lagern sich mit anderen Einzelsträngen zusammen und werden durch DANN-Ligase miteinander verknüpft 3. Markergene Das sind kurze DNA-Sequenzen mit einer bestimmten Funktion. Sie dienen der Selektion oder Identifikation von rekombinanten Plasmiden (siehe Einbau eines Fremdgens) Beispiel: Ampicillin-Resistenz-Gen: Bakterien mit diesem Gen können auf einem Nährboden mit dem Antibiotikum Ampicillin wachsen. Beispiel: B-Galaktosidase-Gen: Bakterien mit diesem Gen stellen ein Enzym her, dass den Zu- cker X-Gal so spaltet, dass ein blauer Farbstoff entsteht. Auf einem Nährboden werden diese Bakterienkolonien also blau, Bakterien ohne das Gen bleiben weiß (Blau-Weiß-Test) Einbau und Nachweis eines Fremdgens Wir wollen als Beispiel das Humaninsulingen in ein Bakterium bringen, sodass...
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Alternativer Bildtext:
diese Bakterien Insulin produzieren (für Diabetiker) Das Plasmid mit den 2 Markergenen (grün: Ampicillin-Res-Gen und blau: B-Gal-Gen) wird mit dem gleichen Restriktionsenzym geschnitten, wie das Humaninsulingen (rot). Dadurch entstehen die gleichen sticky ends und diese können sich zusammen lagern. Das rekombinante Plasmid sieht dann so aus: Durch das B-Gal-Gen wurde hindurch geschnitten, daher ist es nicht mehr funktionsfähig. Nun wird das Plasmid zu den Bakterien dazu gegeben und es gibt 3 mögliche Ergebnisse: 1. Das Bakterium hat gar kein Plasmid aufgenommen 2. Das Bakterium hat das Plasmid aufgenommen mit beiden funktionierenden Markergenen aber ohne Insulin 3. Das Bakterium hat das richtige Plasmid mit Insulin aufgenommen Um nun die Bakterien von einander unterscheiden zu können, lassen wir sie auf einem Nähr- boden mit Ampicillin und X-Gal wachsen. Nr. 1 wächst erst gar nicht Nr. 2 wächst und wird blau Nr. 3 wächst und wird weiß → Die weißen sind die, die wir suchen. Diese isolieren wir von den anderen und vermehren diese.