molekularbiologische Untersuchungen der Verwandtschaftsbeziehungen

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die Ausfällungsgrade als Balkendiagramm dar! 2. Welche Ergebnisse sind zu erwarten, wenn man das Menschenserum einem Pferd anstelle des Kaninchens spritzt? 3. Welche Ergebnisse sind zu erwarten, wenn man a) das Serum eines Esels und b) das einer Kreuzotter testet? Mensch Schimpanse Gorilla Orang Utan Ⓒ GIDA 2016 Rind Pferd Huhn Mögliche Werte der Ausfällungsgrade: 22% 42 % 2% 100% 54% 93 % 10% 83 % TCAGCTGTACG 0% Wenn man das Menschenserum einem Pferd anstelle des Kaninchens spritzt, dann dürfle es eigentlich keinen Unterschied geben, weil das Pferd genauso Antikörper zu den Antigenen herstellen würde. 64 % Wenn man das Serum eines Esels testet, dann müsste die Niederschlagbildung ähnlich wie beim Pferd bei ca. 2% liegen. Wenn man das Serum einer Kreuzotter testet, dann dürfte die Niederschlagbildung sehr gering sein, weil sich Säugetiere und Reptilien genetisch relativ unähnlich sind. Evolution Il Molekularbiol. Forschung Sek. II Arbeitsblatt 3 phylyhydyto L || R₂ phylylydigh C C R₂ H IN N H R₁ ghghghg H R₂ Aminosäure-Sequenzierung - der Edman-Abbau Ordnen Sie die Textbausteine den Reaktionsschritten zu und vervollständigen Sie die Lücken! IN H Ⓒ GIDA 2016 + R₁ jih to N H R₂ to de Zwischen dem C -Atom des PTHs und dem wird eine Bindung ausgebildet PTHS übertragen. unterschiedliche Da jede Aminosäure einen unterschiedlichen Rest R besitzt, bilden sich Ringmoleküle, die chromatografisch aufgetrennt werden können. N -Atom der Aminogruppe Dabei wird ein H-Atom auf das N-Atom des Über mehrere Zwischenschritte reagiert das N-Atom des PTHS mit dem Carboxy-C der ersten Aminosäure des Peptids. Dadurch kommt es zu einem und zur der ersten Aminosäure. Dabei wird das Abspaltung die Aminogruppe der zweiten Aminosäure übertragen. Phenylisothiocyanat (PTH) nähert sich der endständigen ersten Aminosäure des Peptids. CAGCTGTACG zweiten Das nächste PTH reagiert mit der nun endständigen Aminogruppe der Aminosäure des Peptids. PTH, Abspaltung, H, Rest R, C, unterschiedliche, zweiten, ausgebildet, N, Ring, Amino Ring -schluss H-Atom auf Amino -gruppe der Evolution Il Molekularbiol. Forschung Sek. II Arbeitsblatt 4 Nummer Aminosäure Mensch Rhesusaffe Pferd Rind Nummer Aminosäure Mensch Rhesusaffe Pferd Rind Nummer Aminosäure Mensch Rhesusaffe Pferd Rind werden können. Aminosäuresequenz-Vergleich am Beispiel von Cytochrom c Enzym der Atmungshelte 1. Vergleichen Sie die Aminosäuresequenz des Menschen mit denen der Tiere (zellatmung) und markieren Sie auftretende Unterschiede! Ⓒ GIDA 2016 2. Werten Sie die Unterschiede aus und vergleichen Sie das Ergebnis mit dem des Präzipitin-Tests! 3. Es gibt Positionen, an denen sich Unterschiede häufen und andere, an denen keine Unterschiede auftreten. Weshalb verteilen sich die Mutationen wohl nicht statistisch gleichmäßig und zufällig über die gesamte Sequenz? 10 20 30 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 GD VEKGK KIFIMK CSQ CHT VEKG G KHKT G P N L H G L F G R K G D VEKG K KIF IM K C S Q CHT VE K G G KHKTG PNL HGL FGR K GD VEKGK KIF V Q KCAQ CHT VEKG GK H K T G P N L H G L F G RK G D VEKG K KIF V Q K C A Q CHT VEKG G K H K T G P N L H G L F G R K 50 70 40 60 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 TG Q A P G Y SYTA ANK N K GIIWGEDTL MEYLEN PKK YIP GTK TG QAP GYSY TAANKNK GITWGED TL MEYLEN PKKY I PGT K TG QA P GF TYTDAN KNK GITWKEETLMEY LEN PKK YIPGT K TG Q A P GF SYTDAN K N K GITW GEETL MEYLEN PKK YIP GTK 80 90 100 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0 1 2 3 4 MIF V GIKK KEERADLIA YLKKATNE MIF V GIKK KEERADLIA YLKKATNE MIFAGIKK KTER EDLI AYLKKATNE MIFAGIKK KGEREDLI AYLKKATNE CAGCTGTACG 1-Buchstaben- Aminosäurecode: A с Alanin Cystein D Asparaginsäure E Glutaminsäure F Phenylalanin G H I K L M N PORS Q Glycin Histidin | Isoleucin T V W Auswertung: Der Mensch ist recht stark mit dem Rhesusaffen verwandt (1 Abweichung), weniger stark mit dem Rind (10 Abweichungen), und noch weniger stark mit dem Pferd (12 Abweichungen). Vergleich mit dem Präzipitin-Test: Die AS-Sequenzanalyse ist viel genauer, weil hier die Primärstruktur der Aminosäuren ausschlaggebend ist, und nicht allein die Quartärstruktur. Y Mögliche Ursache für die ungleichmäßige Verteilung der Mutationen: Einige Sequenzabschnitte müssen gleich bleiben, damit letztendlich überlebenswichtige Proteine alle synthetisiert Lysin Leucin Methionin Asparagin Prolin Glutamin Arginin Serin Threonin Valin Tryptophan Tyrosin Evolution Il Molekularbiol. Forschung Sek. II Arbeitsblatt 5 zu 1: zu 2: Beschreibung Erklärung Ⓒ GIDA 2016 DNA-Hybridisierung 1. Beschreiben Sie das Verfahren und erklären Sie das Ergebnis! 2. Die Schmelztemperatur einer GC-reichen DNA ist etwas höher als die einer AT-reichen DNA. Weshalb könnte das so sein? °℃ 100 Durch die zugeführte Wärmeenergie trennen sich die Wasserstoffbrücken zwischen den Basenpaaren. gilinin 100 80 60 40 20 TCAGCTGTACG Die DNA-Einzelstränge haben unterschiedliche Basenabfolgen, und passen demnach unterschied- lich gut an den- hier blauen Einzelstrang. PC +100 DNA-Fragmente von mehreren unterschiedlichen Die unterschiedlichen Einzelstränge werden Die verschiedenen Einzelstränge hybridisieren Organismen, die aus identischen Genbereichen stammen zusammengebracht, und die Temperatur wird unterschiedlich, sodass sich die hybritisierten werden in wässrigem Milleau auf 95° erhitzt, wieder gesenkt, sodass sich die verschiedenen Doppelstränge bei erneutem Erhitzen bei sodass sich die DNA-Doppelstränge jeweils in zwei Einzelstränge - so gut es eben geht - wieder anein-unterschiedlichen Temperaturen wieder trennen. Einzelstränge aufteilen. Man spricht von einer ander lagern. Man spricht von einer Hybridi- Die schlecht passenden Einzelstränge trennen Denaturierung. sierung. sich früher, als die besser passenden. 0 Je stärker beide Stränge verbunden sind, desto mehr Energie braucht man, um sie zu trennen. Die Schmelztemperatur einer GC-reichen DNA ist etwas höher als die einer AT-reichen DNA, weil Guanin und Cytosin jeweils drei Wasserstoffbrücken ausbilden, während Adenin und Thymin mit nur zwei Wasserstoffbrücken verbunden sind. Evolution II Molekularbiol. Forschung Sek. II Arbeitsblatt 6 Ausgangsstoffe Desoxy-Nukleotide DNA-Polymerase DNA-Matrize Ⓒ GIDA 2016 DNA-Sequenzierung - das Ketten-Abbruch-Verfahren nach Sanger 1. Benennen Sie die Ausgangsstoffe! 2. Erläutern Sie den Ablauf und geben Sie die ermittelte DNA-Sequenz an! Abbruch-Nukleotide DNA-Primer DEK MPK HEID ΣΚΡ CK ddATP EKT Abbruchnukleotide PHO THK THO THO ddTTP nk THE TH ddCTP ddGTP 15 10 CAGCTGTACG Gelelektrophorese DNA-Sequenz: G GCATGTCGACTA Komplementäre Sequenz: CGTACAGCTGAT Wenn man die Ausgangsstoffe in vier Bechergläser gibt-in denen jeweils nur - für eine spezifische Base Abbruch-Nukleotide enthalten sind dann entstehen in den einzelnen Bechergläsern Strange unterschiedlicher Länge, die jeweils mit der entsprechenden Base enden. Führt man mit den erhaltenen DNA-Strängen nun eine Gelelektrophorese durch, so kann man an dem Gel die komplementäre DNA-Sequenz zur ursprünglichen DNA-Matrize ablesen... Evolution Il Molekularbiol. Forschung Sek. II Arbeitsblatt 7 Nummer Triplett Mensch Rhesusaffe Rind Maus Huhn Nummer Triplett Mensch Rhesusaffe Rind Maus Huhn Nummer Triplett Mensch Rhesusaffe Rind Maus Huhn Nummer Triplett Mensch Rhesusaffe Rind Maus Huhn Nummer Triplett Mensch Rhesusaffe Rind Maus Huhn Ⓒ GIDA 2016 DNA-Sequenzvergleich am Beispiel von Cytochrom c 1. Vergleichen Sie die DNA-Sequenz des Menschen mit denen der Tiere und markieren Sie auftretende Unterschiede! 2. Werten Sie Unterschiede aus und vergleichen Sie das Ergebnis mit dem des Präzipitin-Tests und dem der Aminosäuresequenz-Analyse! 11 21 GAG AAA GGC AAG AAG ATT TTT ATT ATG AAG TGT TCC CAG TGC CAC ACC GTT GAA AAG GGA GAG AAA GGC AAG AAG ATT TTT GTT ATG AAG TGT TCC CAG TGC CAC ACC GTT GAA AAG GGA GAG AAG GGC AAG AAG ATT TTT GTT CAG AAG TGT GCC CAG TGC CAT ACT GTG GAA AAG GGA GAA AAA GGC AAG AAG ATT TTT GTT CAG AAG TGT GCC CAG TGC CAC ACT GTG GAA AAG GGA GAG AAG GGC AAG AAG ATT TTT GTC CAG AAA TGT TCC CAG TGC CAT ACG GTT GAA AAA GGA 31 41 TTT GGG CGG AAG ACA GGT CAG GCC CCT GGA TAC TCT TTT GGG CGG AAG ACA GGT CAG GCC CCT GGA TAC TCT TTT GGA CGA AAG ACA GGT CAG GCT CCT GGA TTC TCT TTC GGG CGG AAG ACA GGC CAG GCT GCT GGA TTC TCT TTT GGA CGC AAA ACA GGA CAA GCT GAG GGC TTC TCT 61 71 ATC TGG GGA GAG GAT ACA CTG ATG GAG TAT TTG GAG AAT CCC ACC TGG GGA GAG GAT ACA CTG ATG GAG TAT TTG GAG AAT CCC ACC TGG GGA GAG GAG ACG CTG ATG GAG TAC TTG GAG AAT CCC ACC TGG GGA GAG GAT ACC CTG ATG GAG TAT TTG GAG AAT CCC ACT TGG GGT GAG GAT ACT CTG ATG GAG TAT TTG GAA AAT CCA 91 TTT GTC GGC ATT AAG AAG AAG GAA GAA AGG GCA GAC TTA ATA TTT GTT GGC ATT AAG AAG AAC GAA GAA AGG GCA GAC TTG ATA GCT GGC ATT AAG AAG AAG GGA GAG AGG GAA GAC TTG ATA GCT GGA ATT AAG AAG AAG GGA GAA AGG GCA GAC CTA ATA GCG GGT ATC AAG AAG AAG TCT GAG AGA GTA GAC TTA ATA (Start) 1 CTC 48 ATG GGT GAT GTT ATG GGT GAT GTT ATG GGT GAT GTT ATG GGT GAT GTT ATG GGA GAT ATT 24 GGC AAG CAC AAG ACT GGG CCA AAT CTC CAT GGT GGC AAG CAC AAG ACT GGG CCA AAT CTC CAT GGT CTC GGC AAG CAC AAG ACT GGG CCA AAC CTC CAT GGT CTG GGC AAG CAT AAG ACT GGA CCA AAT CTC CAC GGT CTG GGC AAG CAC AAG ACT GGA CCC AAC CTT CAT GGC CTG 51 TAC ACA GCC GCC AAT AAG AAC AAA GGC ATC AAC ACA GCC GCC AAT AAG AAC AAA GGC ATC TAC ACA GAT GCC AAT AAG AAC AAA GGT ATC TAC ACA GAT GCC AAC AAG AAC AAA GGC ATC TAC ACA GAT GCC AAT AAG AAC AAA GGT ATC 72 81 AAG AAG TAC ATC CCT GGA ACA AAA ATG ATC AAG AAG TAC ATC CCT GGA ACA AAA ATG ATC AAG AAG TAC ATC CCT GGA ACA AAG ATG ATC TTT AAA AAG TAC ATC CCT GGA ACA AAA ATG ATC TTC AAG AAG TAC ATC CCA GGA ACA AAG ATG ATT TTT 96 100 104 (Stopp) GCT TAT CTC AAA AAA GCT ACT AAT GAG TAA GCT TAT CTC AAA AAA GCT ACT AAT GAG TAA GCT TAT CTC AAA AAA GCT ACC AAT GAG TAA GCT TAT CTT AAA AAG GCT ACT AAT GAG TAA GCA TAT CTC AAA GAT GCC ACT TCA AAG TAA TCAGCTGTACG Gesamtzahl abweichender Basen Rhesusaffe 6 Rind 29 Maus 30 Huhn 58 Vergleich: Die Abweichungen sind deutlich differenzierter, aber die Ergebnisse bezüglich der Verwandtschaft der Menschen mit dem Rhesusaffen bzw mit dem Rind, stimmen einigermaßen überein. Evolution Il Molekularbiol. Forschung Sek. II Arbeitsblatt 8 Bezeichnung des Verfahrens Welche Unterschiede werden ermittelt / gemessen Durchführung des Verfahrens Erklärung der Unterschiede Rangordnung der Genauigkeit (1= am genauesten) Ⓒ GIDA 2016 Gegenüberstellung der molekularbiologischen Untersuchungen der Verwandtschaftsbeziehungen Vervollständigen Sie die Tabelle! Serum-Präzipitin-Test Unterschiede der Proteine im Blutserum einem neutralen Zwischenorga- nismus gespritzt. 1.) Artspezifisches Blutserum wird 1.) Denaturierung der verschiedenen DNA-Doppelstränge 2) Dem Zwischenorganismus wird einige Tage später ebenfalls Blut- Serum entnommen, in dem nun spezifische Präzipitine vorliegen 3.) Dieses Blutserum wird mit den Sera verschiedener Arten gemischt Je mehr Präzipitine am Ende in den einzelnen Reagenzgläsern vorliegen, desto intensiver ist der Niederschlag, und desto höher ist die Artverwandtschaft. DNA-Hybridisierung 4 Unterschiede der DNA-Sequenz (indirekt) 2.) Hybridisierung eines Einzel- stranges mit verschiedenen anderen 3.) Auftrennen der neu entstandenen Doppelstränge Es wird unterschiedlich viel Wärme- energie gebraucht, um die unter - Schiedlich gut aneinander passenden Stränge voneinander zu trennen 2 lle Met Cys Ser Lys Lys Thr Phe Val Gin Lys Cys Ala Aminosäure-Sequenzierung Unterschiede der Aminosäure-Sequenz Es gibt Unterschiede in den ver- schiedenen Aminosäure-Sequenzen 3 AACTC TITT CCG A ACTIT T CAGCTGTACG זוז CCG DNA-Sequenzierung 1.) PTH trennt die Aminosäurekette 1.) Aufteilen der DNA-Matrizen in vier verschiedene Becher - chromatografisch in die einzelnen Aminosäuren auf Unterschiede der DNA-Sequenz (direkt) 1 gläser, in denen jeweils für eine Base spezifische Abbruch- Nukleotide vorliegen 2.) Stränge unterschiedlicher Länge, die jeweils mit der jeweiligen Base enden, entstehen 3.)Auftrennung durch Gelelektrophorese Es gibt Unterschiede in den ver- Schiedenen DNA-Sequenzen